王海迪，蔡钦岭，马 瑞，于旻睆，刘卫敏，魏玉西

(青岛大学生命科学学院，青岛 266071)

甘露聚糖肽(mannatide)是我国首次采用溶血性链球菌发酵法成功制备的一种新型免疫增强剂，具有调节机体防御功能和提高自身抗肿瘤能力的作用，系由不同链长度的甘露聚糖肽分子组成，其中，不存在单糖、双糖等小分子糖类和游离氨基酸。即使甘露聚糖肽原料中含有其他单糖或单糖组成的多糖及不同连接方式构成的糖肽，其含量也很低。因其制备原料单一、价格昂贵，探究甘露聚糖肽其他来源和制备方法成为国内研究热点。

我国食品发酵产业发达，酵母产量巨大，亟待开发高值化利用产品。根据文献报道，酵母细胞壁厚约70 nm，约占细胞干重的20%～30%，酵母细胞壁主要由三类多糖构成：甘露聚糖共价连接到多肽的聚合物(甘露聚糖蛋白，约占细胞壁干重的40%)、葡萄糖聚合物(β-d-葡聚糖，约占细胞壁干重的60%)和-乙酰氨基葡萄糖聚合物(甲壳素，约占细胞壁干重的2%)。啤酒酵母细胞壁中含有丰富的甘露聚糖及蛋白，是制备酵母甘露聚糖肽的良好资源。

甘露聚糖肽在人类临床上主要应用于治疗肿瘤的辅助药，免疫力低下以及白细胞减少症，减轻放化疗对肠胃反应影响等，同时还具有抗病毒、抗呼吸道感染以及特殊的抗菌效果。李守现等通过研究α-甘露聚糖肽对断奶仔猪生长性能的影响，发现甘露聚糖肽可以降低断奶仔猪的发病率及死亡率，增强机体细胞免疫，增强小肠原始淋巴细胞的活性和小肠内白细胞吞噬能力。王利菊和刘耀强发现甘露聚糖肽可以提高机体对各种疾病的抵抗力。甘露聚糖肽进入肠道后可以改善细胞内外的生物活性，主动修复受损的肠道黏膜组织，增强对营养物质的吸收和利用，但目前国内尚未有酵母甘露聚糖肽对动物肠道保护作用的研究报道。

本文将通过酶解、醇沉获得酵母甘露聚糖肽，研究其对致病性大肠杆菌(pec)感染小鼠的保护作用。研究结果为酵母甘露聚糖肽作为新型饲料添加剂提供理论基础。

健康同龄20日龄昆明小鼠(spf级)40只，体质量18 g±2 g；健康同龄60日龄昆明小鼠(spf级)60只，体质量35 g±2 g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。

致病性大肠杆菌(pec)，菌株编号：bncc186732，血清型：o，由青岛大学生命科学学院微生物实验室保存。

本文所用酵母为商品啤酒酵母()，批号：20191208，购自青岛啤酒酵母有限公司。

1.2.1 酵母甘露聚糖肽(mty)制备 参照文献[9]的方法制备并进行含量测定，结果为mty含量达40.04%。

1.2.2 试验分组 小鼠适应性饲喂7 d后，将40只体质量为(18±2)g spf级昆明小鼠随机分为4组：空白组、模型组、阳性药物组、酵母甘露聚糖肽(mty)组，每组10个重复，每个重复1只小鼠。对小鼠进行编号，置于洁净动物房中饲养，采取自由采食、饮水方式，连续喂养28 d。

1.2.3 菌种复苏 参照文献[10]方法，对致病性大肠杆菌(pec)进行复苏。并将复苏后无杂菌的pec接种液体培养基中，收集对数生长期的大肠杆菌，重悬于无菌的pbs中，进行后期注射试验。

1.2.4 灌胃样品 空白组、模型组灌胃生理盐水，用无菌生理盐水根据体质量按1 000 mg·(kg·d)剂量配制mty溶液，按照体质量以100 mg·(kg·d)剂量配制阳性药物(阿莫西林)，各组每次均灌胃0.2 ml，灌胃药现用现配。灌胃期间，均任其自由饮水、采食，并每天观察小鼠的健康状况。

试验开始后，每5 d称量1次小鼠体质量，记录体质量变化情况并绘制图表。

在攻毒前一天取各组小鼠粪便置于灭菌的ep管中，每组取5只，并保存于-80 ℃冰箱，进行后续肠道微生物检测。具体检测方法参照文献[12]，并利用i-sanger平台(美吉生物，上海)进行分析。

小鼠适应性生长7 d后，将60只体质量为(35±2)g的试验鼠分组，按每组10只分为6组，设为6组不同浓度为ldpec半数致死量组，期间均自由采食、饮水。将复苏后pec用pbs稀释至所需浓度，设置6个浓度分别为4.13×10、4.09×10、4.02×10、3.98×10、3.82×10、3.78×10cfu·ml，0.2 ml·只，观察、记录注射pec后小鼠状态及死亡情况。

对模型组、阳性药物组和mty组小鼠进行pec腹腔注射攻毒，每只注射半数致死量浓度的pec溶液0.2 ml，观察小鼠的精神状态。用小鼠存活率来评价mty对pec感染的预防效果。

将小鼠处死后，取各器官组织，除去脂肪以及筋膜，在电子称上称重并记录质量，计算脏器指数。公式：

脏器指数(mg·g)=器官质量(mg)/活体质量(g)。

1.8.1 空肠组织pas染色 采血后，颈椎脱臼处死小鼠，剖开腹腔取空肠组织，用灭菌后的生理盐水冲洗干净，置于甲醛溶液固定24 h后，组织脱水、包埋、切片，石蜡切片脱蜡至水，进行空肠组织pas染色。经染色后杯状细胞被染成紫红色，选取各组空肠组织切片，在200倍显微镜下，每张切片选取10个视野，分别计数后，并取平均数。

1.8.2 muc2、zo-1的免疫组化分析蛋白质表达量 将上述“1.8.1”的石蜡切片经过抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭、加一抗muc2(厂家servicebio，货号gb11344，稀释比1∶1 000)和一抗zo-1(厂家servicebio，货号gb111981，稀释比1∶400)、加二抗hrp标记山羊抗兔igg(厂家servicebio，货号gb23303，稀释比1∶200)、dab显色、复染细胞核、脱水封片等处理，进行空肠组织muc2、zo-1免疫组化分析，利用统计软件image j对免疫组化结果进行分析，通过测量总面积、阳性区域面积与阳性区域累计光密度值，并计算出平均光密度值来衡量蛋白表达量。

1.8.3 器官切片he染色及组织病理分析 取处死后小鼠的空肠、脾、肺、肝，按“1.8.1”步骤制作石蜡切片，随后进行苏木精-伊红(he)染色，镜检在200倍下挑选典型视野拍照，进一步对组织病理进行分析。

饲喂mty未对小鼠体质产生明显影响，小鼠被毛顺滑，活动正常，与空白对照相比未见肉眼可见异常。灌胃期间小鼠表现出较好的状态，饮食、饮水、排泄均正常，并有增加小鼠体质量的趋势，但不显著(>0.05)。阳性药物组相比空白组和mty组，体质量增长较慢，其他未见异常(表1)。

表1 mty对小鼠平均体质量变化的影响table 1 effect of mannatide on the changes of average body weight in g

2.2.1 各组微生物otu 微生物otu数由图1可知，3组中共有otu数为413，空白组、阳性药物组、mty组微生物特有的otu数分别为79、57、71。

con. 空白组；amx. 阳性药物组；man. 酵母甘露聚糖肽组。下同con. blank group; amx. positive drug group; man. yeast mannatide group. the same as below图1 mty对小鼠肠道微生物otu的影响(韦恩图)fig.1 effects of mty on intestinal microbe otu in mice (venn)

2.2.2 beta多样性 bate多样性分析可以评价肠道中物种复杂性方面的差异程度，距离越接近且聚集在一起的样品，表明物种组成结构越相似，通过主坐标分析(pcoa)生成二维散点图2显示，mty组与空白组和阳性药物组之间距离较远，说明mty组与空白组和阳性药物组菌群组成存在差异性。

(1)分隔土体。可采用土工膜等防渗隔水材料，或者非分散性黏土及改性分散性黏土，将低溶盐水和分散性黏土隔离开来。

otu水平上的主成分(pcoa)分析; pc1.主成分1; pc2. 主成分2principal component (pcoa) analysis on otu level; pc1. principal component 1; pc2. principal component 2图2 小鼠肠道内微生物主成分分析fig.2 microbe pcoa analysis in intestinal tract of mice

2.2.3 alpha多样性分析 小鼠肠道微生物alpha多样性见图3、4，alpha多样性可以评价样品内的微生物群落的丰度和多样性，ace指数和chao指数反映群落丰富度，香农·威纳指数(shannon)和辛普森指数(simpson)反映菌群多样性。

α 多样性分析结果；数据柱形标注无字母或相同字母表示差异不显著(p>0.05)，不同小写字母表示差异显著(p0.05),while with different small letters mean significant difference (p0.05)，说明mty

组有增加菌群丰度的趋势。mty组香农(shannon)指数均高于阳性药物和空白组，并显著高于阳性药物组(