李德龙，王思媛，杨云川，刘泓邑，何忆箫，刘锦琳，高继业，李继祥*，陈思怀*

(1.西南大学动物医学院，重庆 402460； 2.西南大学医学研究院免疫学研究中心，重庆 402460)

鸭疫里氏杆菌()是一种不运动、无芽胞、革兰阴性短小杆菌，是鸭传染性浆膜炎的主要病原，鸭疫里氏杆菌已成为严重危害养鸭业的主要病原之一。该病表现为急性、败血性传染病，发病率和死亡率均很高，一旦鸭疫里氏杆菌感染鸭群，就会迅速在鸭群中传播，并有发展为地方流行性疾病的风险。由于鸭疫里氏杆菌血清型众多，且各血清型菌株间缺少交叉免疫保护，耐药性严重，目前疫苗免疫及药物防治鸭传染性浆膜炎均遇到困难，鸭疫里氏杆菌的致病机制及新的防治措施是当前的研究热点。鸭疫里氏杆菌感染可以引起雏鸭严重的组织损伤和炎症反应，但其机制尚不清楚。

补体系统是天然免疫系统的重要组成部分，在维护机体免疫平衡及抵抗病原微生物入侵等方面发挥了重要作用。病原微生物进入机体后，补体系统可以通过3种途径激活：经典途径(classical pathway，cp)、凝集素途径(lectin pathway，lp)和旁路途径(alternate pathway，ap)。3种途径最终均会级联激活c5分子，c5分子进一步裂解为c5a和c5b，c5b通过级联反应与c6-c9形成攻膜复合物(membrane attack complex，mac)，mac可通过裂解方式清除病原。c5a 可以诱导大量的生物学效应，包括增加血管通透性，细胞因子和趋化因子的释放，炎症细胞的趋化作用以及吞噬作用。而c5a发挥这些生物学效应主要是通过其受体来介导和完成，它的受体有两种，一种是c5ar，另一种是c5l2。c5ar是目前研究得最为彻底的一种受体，c5ar在许多细胞类型中均有表达，尤其在嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核巨噬细胞、肥大细胞以及树突状细胞中表达更为丰富。c5a与c5ar的n端结合后可诱导c5ar构象改变并产生一系列反应以激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，mapk)和camp信号通路。c5a-c5ar轴与许多细菌性疾病的发生密切相关，c5a-c5ar轴在某些革兰阴性菌感染模型中可以过度激活，以诱发强烈的炎症反应。应用c5a-c5ar轴拮抗剂(c5a抗体或c5ar抗体)能够减缓疾病发展过程，减轻组织病变.

鸭疫里氏杆菌感染能够引起雏鸭严重的纤维素性渗出性炎症，推测在鸭疫里氏杆菌感染中c5a-c5ar轴发挥了重要作用。因此本研究通过全血试验和动物试验，从体外和体内水平上验证c5a-c5ar轴激活对鸭疫里氏杆菌感染雏鸭组织损伤及炎症反应的影响，阻断c5a-c5ar轴能显著降低雏鸭发病率和死亡率及炎性因子的表达水平，减轻组织损伤。研究结果对于进一步阐明鸭疫里氏杆菌致病机制具有重要意义，同时也将为后续开发针对鸭疫里氏杆菌新的疫苗靶点提供理论依据。

1.1.1 菌株和试验动物 鸭疫里氏杆菌af株由西南大学动物医学院动物疫病防控与兽医公共卫生研究室分离并保存。10日龄健康雏鸭(樱桃谷鸭)购自重庆永健生物技术有限公司，所有试验用鸭经本实验室检测鸭疫里氏杆菌阴性。

1.1.2 主要试剂 鸭c5a、tnf-α、il-6和il-1β elisa检测试剂盒购自上海泛柯实业有限公司。prime rt reagent kit with gdna eraser (perfect real time)、dl2000 dna marker、depc、premix taq、tb greenpremix ex taqii购自宝生物工程(大连)有限公司；荧光定量pcr八联管购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2.1 兔抗c5a抗体和兔抗c5ar抗体制备 为制备兔抗c5a抗体和兔抗c5ar抗体，根据鸭c5(genbank no. xp_027326464.1)和c5ar(genbank no. xp_027303283.1)序列进行结构分析，选取c5a和c5ar功能区序列，依据大肠杆菌最适密码子进行合成，将合成的c5a片段及c5ar片段克隆至原核表达载体pet-32a(+)，分别命名为pet-32a-c5a和pet-32a-c5ar。将pet-32a-c5a和pet-32a-c5ar转化至大肠杆菌bl21(de3)，用1.0 mmol·liptg诱导表达蛋白，重组蛋白经sds-page检测，镍柱亲和层析纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体，间接elisa测定多抗效价，western blot鉴定多抗特异性。

1.2.2 全血试验 新鲜鸭外周血采自10日龄雏鸭，以肝素钠为抗凝剂制备抗凝血。将-80 ℃保存的鸭疫里氏杆菌af菌种划线接种于巧克力营养琼脂平板，37 ℃培养至单菌落形成；挑取单菌落接种于lb液体培养基中，37 ℃振荡培养至饱和；细菌悬液于4 ℃条件下5 000 r·min离心15 min，菌泥用0.01 mol·lpbs(ph7.4)重悬洗涤2次，制成终浓度为1×10cfu·ml菌液。试验分为4组，第1～3组的5 ml抗凝血中分别加入15 μl鸭疫里氏杆菌悬液，第4组加入15 μl pbs，混匀；第1～2组分别加入15 μl的兔抗c5a抗体和兔抗c5ar抗体，第3～4组分别加入15 μl灭活兔健康血清，轻轻混匀；于37 ℃恒温摇床中孵育1、2和4 h后取样，加入20 mmol·l乙二胺四乙酸二钠，2 500 r·min离心10 min，分离血浆，于-80 ℃保存备用。

1.2.3 动物试验 依据“1.2.2”中的方法制备鸭疫里氏杆菌菌液，调整浓度为1×10cfu·ml。在进行动物试验之前筛选兔抗c5a抗体和兔抗c5ar抗体最佳注射剂量和注射时间，经测定，兔抗c5a抗体和兔抗c5ar抗体最佳注射剂量为0.5 ml·只，最佳注射时间为鸭疫里氏杆菌感染同时皮下注射抗体。

44只10日龄健康雏鸭随机分为4组，每组11只，隔离饲养。第1～3组动物颈部皮下注射5×10cfu·ml鸭疫里氏杆菌后，分别腿部皮下注射0.5 ml兔抗c5a抗体、c5ar抗体和灭活健康兔血清；第4组为健康对照组，颈部皮下注射0.5 ml pbs和腿部皮下注射0.5 ml灭活健康兔血清。每组动物随机分成2个小组，第1小组5只，用于每日观察记录发病率、死亡率和临床症状；第2小组6只，于感染后12、24、48和72 h经颈静脉采血，制备抗凝血和分离血清。鸭疫里氏杆菌感染后72 h捕杀第1小组的全部雏鸭，采集心、肝和脾进行组织病理学检查，采集肝用于载菌量测定和基因表达检测。

1.2.4 组织病理学检查 鸭疫里氏杆菌感染72 h处死全部雏鸭，尸体剖检观察主要组织器官病理变化，并用10%福尔马林固定心、肝和脾制备病理组织切片，进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，he)染色，光学显微镜观察。

1.2.5 血清酶活性测定 鸭疫里氏杆菌感染后12、24、48和72 h，采集各组雏鸭颈静脉血，分离血清，利用迈瑞mindray生化分析自动仪检测血清中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，alt)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，ast)的含量。

1.2.6 外周血及肝细菌数量测定 在无菌条件下采集捕杀鸭肝组织，称量后玻璃研磨器中研磨，加入灭菌生理盐水混匀，室温静置10 min，上层匀浆液用于细菌计数，计数方法参照文献[24]，并进行适当改进。利用巧克力营养琼脂平板以涂布的方式进行抗凝血和肝组织匀浆液的细菌计数，样品10倍递进稀释，每个样品选择3个合适的稀释度，每个稀释度的样品涂布3个营养琼脂平板，0.1 ml·板。在37 ℃恒温培养箱培养18～24 h至菌落形成后计数。

1.2.7 c5a及炎性因子测定 利用商品化elisa检测全血试验和动物试验中采集的血清样品c5a、tnf-α、il-6和il-1β水平。具体步骤：标准品孔各加不同浓度的标准品50 μl；加样孔分为空白孔和待测样品孔，待检样品孔中加样品稀释液40 μl和待测样品10 μl；加入酶标试剂100 μl·孔，空白孔除外； 37 ℃恒温培养箱中孵育1 h；弃掉液体，加入洗涤液300 μl·孔，重复5次；每孔加入底物a、b各50 μl，37 ℃避光孵育15 min；加入终止液50 μl·孔，15 min内用酶标仪测定od。

1.2.8 荧光定量pcr检测肝各基因的表达 利用trizol抽提法提取肝总rna，然后根据反转录试剂盒说明书进行反转录扩增cdna，荧光定量pcr检测c5ar、鞘氨醇激酶-1(sphingosine kinase 1，sphk1)、纤维蛋白原样蛋白2(fibrinogen-like protein 2，fgl2)、-α和-1β mrna水平，-为内参基因。各基因引物：c5ar-f：cagctccttgttcaagagcg；c5ar-r：catcaccacgtagatgatggg；sphk1-f：gaagaagctgc-tgacgaact；sphk1-r：gcccaggaaggaga-agaaac；fgl2-f：gtacctgaagtaccgtc-taagcg；fgl2-r：atgccccacagtttcctgag；tnf-α-f：cagatgggaagggaatgaa-c；tnf-α-r：gaactgggcggtcataaaat；il-1β-f：gcttcatcttctaccgcctggac；il-1β-r：ttagcttgtaggtggcgatgttgac；β-actin-f：accgcaaatgcttctaaacc：β-actin-r：atcctgagtcaagcgccaaa。反应体系：sybr green mix 12.5 μl，模板2 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，depc水8.5 μl。反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，40 个循环。采用相对比较值法对数据进行分析，先计算各组差值(Δct=目的基因ct-内参基因)；再计算ΔΔ(即Δ—Δ)，最后将结果转化相对差异倍数(=2-ΔΔ)。

1.2.9 统计学分析 数据采集自3次独立重复试验，不同组别的数据统计为mean±s.e.m.，用单因素方差分析和bonferroni 检验分析各组之间的差异显著性，分析软件是spss 20.0(spss inc., chicago, il, usa)，