李 琛，何文峰，赵丽娜，凡 启，杨国庆，刘慧敏

(河南农业大学生命科学学院，郑州 450002)

伪狂犬病(pseudorabies，pr)是由伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，prv)引起的可感染多种家畜和哺乳动物的急性传染病，以发热、奇痒(猪除外)及急性脑脊髓炎为主要症状。prv属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科。猪是prv的唯一自然感染宿主以及长期贮存和传播宿主。prv感染猪后可建立持续性感染，主要潜伏在猪的外周神经组织，在机体免疫低下或受到应激时可被激活，导致机体发病甚至成为传染源。prv特殊的致病方式和感染方式给该病的防控带来较大困难，严重危害全球养猪业的发展。近年来，prv更是突破了常规疫苗，导致猪伪狂犬病的防控难度极大，成为养猪业防控伪狂犬病所面临的巨大挑战。

在病毒入侵机体过程中，宿主产生各种防御机制来保护机体，先天性免疫应答是抵抗入侵病原体的第一道防线。prv对宿主细胞的感染力很强，能够引起宿主细胞产生免疫反应，诱导产生Ⅰ型ifn，分泌的ifn与其受体结合激活下游信号转导，最终导致数百个干扰素刺激基因(isgs)的表达。其中，isg15(interferon-stimulated gene15)作为诱导最强烈、反应最快的isg蛋白之一，在宿主抵御病毒感染的过程中发挥重要的作用。

近年来，对isg15抗病毒复制的作用有越来越多的研究。isg15可以通过作用于病毒入侵的各阶段影响病毒的增殖，也可以作为免疫调节蛋白来调控宿主的反应。本实验室前期研究发现prv感染能显著上调isg15，过表达isg15能明显抑制prv复制。但是isg15抑制prv复制的分子机制尚不清楚，有待进一步研究。在前期试验基础上，本研究利用crispr/cas9基因编辑技术，构建15基因敲除pk-15细胞系(pk15-isg15)，利用prv毒株检测敲除15基因对prv复制的影响，以期为进一步研究isg15抑制prv 复制的分子机制提供新思路，同时为有效防控猪伪狂犬病提供新的研究策略。

猪肾上皮细胞(pk-15)、prv、isg15兔多克隆抗体由作者实验室保存；pcompass-lvko 载体购自addgene；载体质粒pmd2.g和pspax2购自sigma；普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天根生化科技有限公司；限制性内切酶Ⅰ、rnaiso plus、prime rt reagent kit with gdna eraser、primer starmax dna polymerase购自宝日医生物技术有限公司；monampsybrgreen qpcr mix试剂购自莫纳生物科技有限公司；prv鼠源ge单克隆抗体购自普莱柯生物工程股份有限公司；β-actin抗体购自赛维尔生物科技有限公司；cell counting kit-8购自生工生物工程股份有限公司。

根据ncbi网站所公布的猪15基因序列(genbank no.：nm_001128469)，在15的单一外显子上找到2个合适的靶位点，将此靶序列与猪的基因组序列进行比对，仅在15基因座上找到完全匹配序列，针对2个位点分别设计sgrna上游引物与下游引物，同时，在基因组靶序列两侧设计15的验证引物(表1)；通过ncbi数据库查询需要检测的基因 mrna序列，应用primer-blast设计rt-qpcr引物(表1)。

表1 引物序列及相关信息table 1 sequences and information of primers used in our study

1.3.1 敲除载体的构建 将两对sgrna引物95 ℃ 5 min进行退火杂交，退火后连接至Ⅰ限制性内切酶线性化的pcompass-lvko载体中。重组载体送北京擎科生物科技有限公司测序，将测序正确质粒命名为pcompass-lvko-isg15-1、pcompass-lvko-isg15-2，转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，挑取单菌落扩大培养，提取质粒后，-20 ℃保存备用。

1.3.2 敲除细胞系的构建 将pcompass-lvko-isg15-1、pcompass-lvko-isg15-2与pspax2、pmd2g以2∶1∶1的比例，共转染hek293t细胞；培养48 h后收集包装病毒上清液，取1 ml感染pk-15细胞，感染48 h后，用2 μg·ml嘌呤霉素筛选细胞，使用胰酶消化存活细胞，梯度稀释后，按照每孔1个细胞的比例接种至96孔板，37 ℃，5% co培养扩增细胞。取15完全敲除的克隆，抽提基因组dna后以此为模板，使用验证引物isg15 verf和isg15 verr进行pcr扩增，20 μl反应体系：primerstar max premix 10 μl,上、下游引物(0.2 μmol·l)各0.4 μl，模板1 μl，ddho 8.2 μl。反应条件：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 5 s，共35个循环；72 ℃ 5 min。如果在619 bp处出现一条特异性条带，可初步说明敲除15细胞构建成功，将此条带连接至peasy-t1 simple载体，随机挑选阳性克隆送公司测序。

6孔板铺种pk-15和pk15-isg15细胞，各设3组重复。培养至细胞汇合度70%左右接种病毒，以prv moi=2感染细胞，感染24 h收取蛋白，bca法检测蛋白浓度。取35 μg蛋白样品进行sds-page电泳后转膜，5%脱脂奶室温封闭1 h后，加入isg15兔多克隆抗体(1∶5 000)4 ℃摇床孵育过夜，tbst洗膜3次，室温孵育hrp标记的羊抗兔igg(1∶5 000)1 h，ecl显影。以β-actin作为内参。

以每孔1×10个细胞在96孔板中铺种pk-15和pk15-isg15细胞，每个处理设置5个复孔，培养24 h。参照cck-8试剂盒在不同时间点向指定培养孔中加入10 μl的cck-8溶液，37 ℃孵育2 h，随后用酶标仪检测在450 nm处的吸光度。试验重复3次。

12孔板铺种pk-15和pk15-isg15细胞，各3个重复，培养至细胞汇合度70%左右进行病毒处理，以prv moi=2感染细胞，24 h后取出，pbs洗涤两次，然后使用4%多聚甲醛室温固定15 min，使用破膜液渗透15 min。然后用封闭缓冲液(含5%脱脂奶粉的pbs)封闭细胞1 h后，加入鼠源prv-ge抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜。pbs清洗后，室温避光孵育fitc标记的山羊抗小鼠抗体(1∶200)，pbs清洗3遍。滴入封片剂平铺覆盖细胞，倒置荧光显微镜下观察。

6孔板铺种pk-15和pk15-isg15细胞，各3组重复。培养至细胞汇合度70%左右进行病毒处理，以prv moi=2感染细胞，分别在0、6、12、24、36和48 h收取rna。trizol法提取rna并反转录成cdna，以cdna为模板，进行rt-qpcr检测。每个样品3个重复。反应体系20 μl：monampsybr green qpcr mix 10 μl，上、下游引物(0.2 μmol·l)各0.4 μl，cdna 3 μl，ddho 6.2 μl。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火和延伸30 s，共40个循环。以-mrna表达水平为内参值，计算prv-0、prv-、prv-16、-β mrna水平。

6孔板铺种pk-15和pk15-isg15细胞，各3组重复。培养至细胞汇合度70%左右进行病毒处理，以prv moi=2感染细胞，感染0、6、12、24、36和48 h收取蛋白，bca法测蛋白浓度。取35 μg蛋白样品进行sds-page电泳后转膜，5%脱脂奶室温封闭1 h后，加入isg15兔多克隆抗体(1∶5 000)4 ℃摇床孵育过夜，tbst洗膜3次，室温孵育hrp标记的羊抗兔igg(1∶5 000)1 h后ecl显影。以β-actin作为内参。image j软件分析条带灰度值比较isg15敲除对prv-ge蛋白表达的影响。

取对数生长期pk-15和pk15-isg15细胞接种于6孔板。培养至细胞汇合度70%左右，弃去细胞培养物，pbs洗2遍，将稀释好的prv病毒液400 μl接种到各孔中，置于37 ℃、5% co培养箱1 h，期间每隔15 min摇晃一次，以便病毒吸附；弃去病毒液，加入含1%琼脂糖细胞维持液覆盖各孔，置于37 ℃、5% co培养箱培养3 d，取出细胞培养板，10%福尔马林固定30 min，弃去细胞覆盖物，pbs洗2遍，用0.5%结晶紫染色30 min，选择合适的稀释度进行计数。

取对数生长期pk-15细胞稀释接种于6孔板。培养至细胞融合度70%左右，进行分组处理：第1组直接用prv(moi=2)感染细胞；第2组将prv与bsa于37 ℃孵育1 h后加入细胞；第3组将prv与isg15蛋白孵育1 h后加入细胞。吸附1 h后，更换成2%维持培养基，24 h后收取细胞总rna、总蛋白和上清。分别检测prv-ge的mrna和蛋白表达，以及子代病毒的增殖。

各试验均平行重复3次，通过graphpad prism 8.0软件中-test检验方法对数据结果进行统计学分析。

为构建15基因敲除pk-15细胞系，针对猪源15的第二外显子，设计了两个特异性的crispr-cas9 sgrna。利用Ⅰ末端序列将sgrna克隆到pcompass-lvko载体上，挑取单个菌落进行dna测序，测序结果表明，重组质粒pcompass-lvko-sgrna构建成功(图1)，提取质粒用于后续试验。

框内序列分别为sgrna1和sgrna2序列the sequences in box are sgrna1 and sgrna2 sequence respectively图1 pisg15-sgrna测序结果fig.1 sequencing results of pisg15-sgrna

将构建成功的质粒pcompass-lvko-sgrna转染pk-15细胞，并以pcompass-lvko空载体作为阴性对照。转染24 h后进行嘌呤霉素筛选，通过有限稀释法挑选单克隆。单克隆扩大培养后提取细胞总rna，反转录为cdna模板对15进行pcr扩增。结果显示,在619 bp处有出现一条特异性条带，初步说明该敲除细胞构建成功 (图2a)。将阳性克隆进行测序鉴定，与对照细胞的序列对比分析结果显示，sgrna1细胞株的15基因外显子打靶区缺失20 bp碱基，sgrna2细胞株的15基因外显子打靶区缺失8 bp碱基，选取sgrna2 细胞株进行后续功能评价，并命名为pk15-isg15。

a. pcr扩增(m.dl5000 dna相对分子质量标准；1～3. 阳性克隆细胞pcr结果；4. pk-15细胞为阴性对照)；b. pk15-isg15-/-单克隆细胞测序结果a. pcr amplification (m. dl5000 dna marker; 1-3. the isg15 pcr results of cell colonies; 4. pk-15 cell as a negative control); b. sequencing results of pk15-isg15-/- monoclonal cell图2 pk15-isg15-/-单克隆细胞的筛选fig.2 screen of pk15-isg15-/-monoclonal cell line

为验证15敲除效率，western blot检测pk-15和pk15-isg15细胞中isg15蛋白的表达水平。结果表明，在pk-15细胞中可见明显的isg15条带，而pk15-isg15细胞中没有检测到isg15的表达，证实pk-15细胞中15基因完全敲除(图3a)。

a. western blot检测isg15敲除效率(1.pk-15细胞；2.pk15-isg15-/- sgrna1；3.pk15-isg15-/- sgrna2)；b. 敲除isg15基因对细胞增殖无影响。ns.差异不显著a. isg15 knockout efficiency by western blot(1. pk-15 cell; 2. pk15-isg15-/- sgrna1 polyclonal cell; 3. pk15-isg15-/- sgrna2 polyclonal cell); b. isg15 gene knockout can induce the replication of pk-15. ns. no significant difference图3 isg15基因敲除细胞系的鉴定fig.3 identification of pk-15 cell line knockout of isg15 gene

通过cck-8检测敲除15基因后是否影响细胞增殖活性。结果显示，敲除15基因后pk15-isg15细胞与pk-15细胞相比，od波长吸光度值差异不显著(>0.05)，结果表明，15基因敲除对pk15细胞的增殖没有显著影响(图3b)。

为了研究isg15对prv复制的影响，作者评估了prv在pk-15和pk15-isg15细胞中的复制状态。用moi=2的prv分别感染pk15细胞和pk15-isg15细胞，通过间接免疫荧光检测prv蛋白的表达，发现在感染后的不同时间点，prv在pk15-isg15细胞中的表达显著高于pk-15细胞中的表达(图4)。该结果初步表明，敲除15显著促进prv复制。

荧光显微镜观察prv感染pk-15及pk15-isg15-/-细胞对病毒复制的影响(80×)effect of prv infecting pk-15 and pk15-isg15-/- cells on viral replication observed by fluorescence microscopy(80×)图4 敲除isg15基因促进prv复制fig.4 knockout of isg15 gene promotes prv replication

为进一步验证15基因敲除对prv复制的影响，利用rt-qpcr检测pk15-isg15细胞在感染prv后的不同时间点，prv-0、prv-、prv-16的mrna水平。与对照组pk-15细胞相比，pk15-isg15细胞中 prv-0、prv-、prv-16的mrna水平极显著升高(