钟昊然，侯 玲,，桂 祥，吕荣雪，刘金明，古少鹏，金亚美*

(1.中国农业科学院上海兽医研究所，国家动物血吸虫病参考实验室，上海 200241；2.山西农业大学动物科技学院，太谷 030801)

血吸虫病是仅次于疟疾的全球第二大寄生虫病，广泛分布于亚热带与热带的76个国家和地区，对人畜健康造成严重危害。血吸虫虫体呈线形，雌雄异体，在感染过程中，虫体不会对宿主造成明显的病理损害，而成熟雌虫所产虫卵不仅造成宿主严重病理损害，还引起疾病的再传播。在全球广泛流行的三种感染人类的血吸虫中(日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫)，日本血吸虫()产卵量最大。日本血吸虫所产虫卵主要沉积于肝与肠道，沉积于肝的虫卵分泌的可溶性虫卵抗原(soluble egg antigens，sea)刺激宿主免疫系统，导致细胞外基质(extracellular matrix，ecm)过度沉积，进而引发肉芽肿和继发性肝纤维化等病理变化。日本血吸虫病肝纤维化若治疗不当或不及时可发展为慢性血吸虫病。日本血吸虫病晚期患者即使进行了彻底的杀虫治疗，宿主体内未成熟虫卵仍可继续发育，导致虫卵肉芽肿反应持续进行。尽管已去除诱因，但当肝纤维化发展到一定程度时，病症往往不可逆转，而当发展为肝硬化、肝细胞癌时，患者将出现肝脾肿大、门脉高压等症状，最终可因上消化道出血等严重并发症致死。

高迁移率族蛋白b1(high mobility group box 1，hmgb1)是高迁移率族蛋白家族成员，广泛分布于哺乳动物组织中，参与众多生物学功能，例如dna复制、转录、修复以及细胞增殖、分化、运动等。当肝细胞受损时，hmgb1可作为一种炎性因子，由损伤坏死的肝细胞被动释放，通过与糖基化晚期终末产物受体(receptor for advanced glycation end products，rage)和toll样受体结合，进一步诱导机体炎症反应。近年来研究表明，hmgb1与各类纤维化疾病也密切相关，如肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化以及心肌纤维化等。此外，在曼氏血吸虫()病肝纤维化患者的血清和肝中均可检测到高水平hmgb1表达，证实hmgb1参与血吸虫致肝疾病。然而，hmgb1在日本血吸虫病肝纤维化的致病过程中扮演何种角色却鲜有研究。

日本血吸虫虫卵分泌物引起的免疫反应是导致宿主肝病变的主要原因。本研究构建了日本血吸虫肝病模型，并在虫卵发育早期给予小鼠甘草甜素(glycyrrhizin，gl，hmgb1抑制剂)，观察gl能否通过抑制hmgb1对血吸虫虫卵导致的宿主肝病变起保护作用，初步探究了hmgb1与宿主肝炎症和纤维化的相关性，为进一步阐明日本血吸虫病肝纤维化的致病机理奠定基础，同时也为慢性日本血吸虫病治疗药物靶点的选择提供重要参考。

spf级雄性balb/c小鼠25只，6周龄，购自上海杰思捷实验动物有限责任公司[scxk(沪)2018-0004]。每天12 h光照，12 h黑暗循环，饲养过程中给予全价饲料，自由饮水。中国大陆株日本血吸虫尾蚴由中国农业科学院上海兽医研究所血吸虫课题组钉螺室提供。本试验通过了中国农业科学院上海兽医研究所实验动物福利与伦理管理委员会审查(sv-20210709-02)。

hmgb1抑制剂甘草甜素(glycyrrhizin，gl)，羧甲基纤维素钠(中国 abmole)；hieff qpcr sybr green master mix，hifair ii 1 st strand cdna synthesis kit，masson染色试剂盒(上海翊圣生物科技)；trizol(北京天根生化科技)；血细胞分析仪(深圳迈瑞bc5300)；全自动生化分析仪(深圳雷杜生命科技)；nanodrop 2000核酸测定仪(美国 thermo)；abi 7500实时荧光定量pcr仪(美国abi)；光学显微镜(日本尼康eclipse80)。

将25只balb/c小鼠随机分为空白对照组(=10)，感染后4周组、6周组和hmgb1抑制剂组(=5)。小鼠腹部去毛，在解剖镜下计数日本血吸虫尾蚴，除空白对照组外，其余各组小鼠通过腹部贴片法感染日本血吸虫尾蚴，每只小鼠感染(20±2)条尾蚴。将gl溶于0.5%羧甲基纤维素钠溶液中，配制成6.25 mg·ml的溶液，hmgb1抑制剂组每只小鼠自感染后24 d起连续4 d灌胃0.2 ml gl溶液(即每只小鼠50 mg·kg)，4周空白对照组与感染组则连续4 d灌胃等体积生理盐水。尾蚴感染4、6周后，分别对各组小鼠进行眼眶静脉采血，采集肝右叶置于4%多聚甲醛固定，用于病理切片制作，采集肝左叶置于液氮速冻后-80 ℃保存，用于提取肝组织总rna。

用含180 μl稀释液的1.5 ml离心管收集100 μl血液，吹打混匀，室温放置2 min后用血细胞分析仪检测白细胞(white blood cell，wbc)、嗜中性粒细胞(neutrophils，neu)、单核细胞(monocytes，mon)和嗜酸性粒细胞(eosinophil，eos)。剩余全血于4 ℃静置30 min，400×离心15 min，收集上层血清用全自动生化分析仪检测ast和alt。

将采集的肝样品，置于4%多聚甲醛中溶液中，固定48 h后取出，流水冲洗12 h；进行乙醇梯度脱水、二甲苯透明及浸蜡后包埋于石蜡中；常规切片，采用苏木精-伊红(he)染色，中性树胶封片后镜检。用image j软件测量每张切片中由单个虫卵形成的虫卵肉芽肿面积，并计算每张切片中的所有虫卵肉芽肿的总面积与每张肝切片面积的比值。此外，每张切片任选5个视野，根据肝纤维化病理ishak评分标准进行评分，评分标准见表1。

表1 肝纤维化病理ishak评分标准table 1 ishak index score of liver fibrosis

将小鼠肝切片按masson染色试剂盒说明书进行染色，中性树胶封片后镜检。每张切片任选5个视野，用image j软件计算蓝色胶原纤维面积，胶原面积的百分比越高，肝纤维化程度越高。

用trizol法提取肝组织总rna。随后采用nanodrop 2000核酸测定仪测定总rna浓度，总rna经hifair ii 1st strand cdna synthesis kit试剂盒反转录得到cdna。自ncbi genbank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)获得高迁移率族蛋白 b1(1，no. nm_010439.4)，白细胞介素-1β(-1，no. nm_008361.4)，肿瘤坏死因子α(-，no. nm_013693.3)，白细胞介素-6(-6，no. nm_031168.2)，干扰素γ(-，no. nm_008337.4)，α平滑肌肌动蛋白(-，no. nm_007392.3)，Ⅰ型胶原α1(11，no. nm_007742.4)，转化生长因子β1(-1，no. nm_011577.2)，smad蛋白2(2，no. nm_010754.5)，smad蛋白3(3，no. nm_016769.4)及内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(, no. nm_008084.3)的序列，设计引物，由上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列见表2。使用hieff qpcr sybr green master mix进行荧光定量rt-pcr。反应体系为5 μl hieff qpcr sybr green master mix，正反向引物各0.5 μl，2 μl cdna模板，补去离子水至10 μl。反应程序为95 ℃预变性2 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 5 s；95 ℃ 50 s。各基因mrna转录水平采用相对定量方法(2-ΔΔ)。

表2 荧光定量pcr引物序列table 2 primers used for rt-pcr

数据处理采用spss 17.0软件，使用单因素方差分析(one-way anova), *表示差异显著(