C型产气荚膜梭菌外毒素致小鼠肠道损伤的转录组分析
张思雨,王玉炯*,曾 瑾*
(1.宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室,银川 750021;2.宁夏大学生命科学学院,银川 750021)
产气荚膜梭菌()是一种短杆状、无鞭毛、不运动、有荚膜、可形成内生孢子的专性厌氧的革兰阳性菌。该菌能产生至少18种外毒素和酶类;传统上,依据其产生的主要致死性毒素与其抗毒素的中和试验可将产气荚膜梭菌分为a、b、c、d和e 5个血清型,而在2017年美国安娜堡举行的“第十届梭状芽胞杆菌分子生物学及其发病机制”国际会议上对该菌的分类扩展到7个类型(a~g)。其中,毒力较强的主要是a型和c型产气荚膜梭菌,c型菌株定义为携带2个分型毒素基因(编码α毒素)和(编码β毒素)的产气荚膜梭菌。
该菌引起的多种动物的气性坏疽、肠毒血症、坏死性肠炎(intestine necrotic, in)难以预防和治疗,流行范围广,从而引起大量的关注。在产气荚膜梭菌引起的人类食源性疾病中,原因通常是病患食用了受到该菌污染的生肉及其制品,这些受污染的食品会由于不当的加工和保存,造成该菌的大量繁殖并分泌外毒素,从而引起食源性感染疾病。据美国疾病预防控制中心(cdc)统计,产气荚膜梭菌病是美国第二大常见的食源性疾病,占总发病率的26%。我国居民饮食结构多以熟食为主,由产气荚膜梭菌所引起的食源性感染事件较少,但也有相关的感染食源性疾病暴发的事件报道。
产气荚膜梭菌病在畜禽养殖生产中的危害性更令人关注。特别是近年来“禁抗令”的实施,伴随抗生素类生长促进剂从动物饲料中撤出,产气荚膜梭菌所引发的坏死性肠炎的患病率明显增加。该菌所产生的外毒素可影响牛、羊、猪以及禽类等几乎所有的养殖动物,患病动物往往在短时间内迅速发病,常常会出现休克乃至死亡;该病对幼年动物的影响尤为严重,即使是经大量抗生素治疗后存活下来的幼畜,也常常会出现发育迟缓以及坏死性肠炎的亚临床现象,而亚临床感染可以削弱畜禽的生长速度,降低饲料转化率,减少体重增加,使其养殖生产性能受到严重的影响,并导致重大经济损失。据报道仅c型产气荚膜梭菌每年给全球家禽业造成约60亿美元的生产损失和控制成本。
产气荚膜梭菌是利用其分泌的大量蛋白质毒素在人类和动物中产生肠道感染、组织毒性以及神经反应等疾病状态的。在一些条件下,人或动物摄入产气荚膜梭菌,或黏附在消化道内壁上的该菌过度繁殖,迅速产生多种毒素和侵袭性酶,毒素作用于肠道中的多种靶细胞上的受体,激活细胞内信号通路,进而产生多种效应。在研究产气荚膜梭菌感染的发病机制时,宿主和细胞敏感性似乎是需要考虑的关键因素,因此,常常选择产气荚膜梭菌相关疾病的体外或动物模型解决这个问题,而发病机制作为病理机制中的初期环节,可提供治疗该病的重要靶点。而机体在响应产气荚膜梭菌感染时,也会启动免疫应答、代谢调控等一系列复杂的生物学过程。在这其中,涉及大量调控反应的相关蛋白的表达,以及关键信号通路的激活或抑制。目前,随着现代技术的日益发展,越来越多的研究者采用高通量测序技术分析基因表达和信号通路富集情况,探究病原菌致病的分子机制,挖掘关键基因作为靶点。比如刘乐文对感染肠炎沙门菌鸡的盲肠组织进行mrna与mirna测序,分析后发现:表达上调的mrna包含169个表达下调mirna的靶基因,主要富集在免疫反应、炎症反应、细菌防御反应、toll样受体信号通路等与机体免疫相关的生物学过程。张旭等对感染鸭肠炎病毒的樱桃谷鸭的十二指肠组织进行测序,通过go和kegg数据库分析发现,差异表达基因主要富集在nod样受体信号通路、toll样受体信号通路、il-17信号通路等。也有关于产气荚膜梭菌的转录组研究,比如姜天团对灌服c型产气荚膜梭菌培养菌液的仔猪回肠组织进行蛋白组学和转录组学测序,联合分析发现能量代谢、免疫响应、细胞膜结构、肠道炎症等方面的变化可能介导仔猪对c型产气荚膜梭菌的耐受性或易感性。但是,产气荚膜梭菌的致病因子是其产生的多种外毒素和侵袭酶,该菌所分泌的毒素种类和数量受培养基成分、ph以及培养温度等条件的影响而具有显著的差异;同时还受到菌体virs/virr毒力调节系统以及agr群体传感系统的影响。因此,本研究规避了产气荚膜梭菌的产毒条件所带来的干扰,直接采用经脑心浸液中培养的c型产气荚膜梭菌培养上清感染小鼠,通过rna-seq技术对肠道组织转录组的变化进行分析,筛选差异表达基因,通过go功能注释和kegg通路富集筛选关键信号通路,以期为c型产气荚膜梭菌分泌外毒素致机体损伤的致病机理研究提供理论基础和新的思路。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物 spf级6周龄balb/c雌性小鼠,体质量均为20 g左右,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验动物常温培养于12 h明暗交替的动物实验室,保证其自由饮水、摄食。标准饲养3~5 d后进行试验。
1.1.2 菌株与试剂 产气荚膜梭菌中国标准株c59-2(c型)由本实验室保存,脑心浸液培养基购自英国oxoid公司,产气荚膜梭菌b型菌株鉴定血清和c型菌株鉴定血清均来自于中国农业科学院兰州兽医研究所,1k19单克隆抗体和2g7单克隆抗体均由本实验室制得。
1.2 方法1.2.1 毒素蛋白表达检测 将产气荚膜梭菌c59-2菌株复壮后培养于脑心浸液培养基中,培养至第4代,离心菌液收集培养上清,并通过0.22 μm细菌滤器过滤获得上清,加入2×蛋白上样缓冲液,于100 ℃金属浴中煮5 min,制得蛋白免疫印迹样品。样品分别经过电泳、转膜、封闭、孵育一抗(具体见图1图注)、洗涤、孵育二抗(山羊抗鼠igg,proteintech)、洗涤以及显影过程,以分析毒素蛋白表达情况。
1.2.2 样本采集 产气荚膜梭菌c59-2培养上清经0.22 μm滤器过滤后备用;以不同剂量(10、20、40、80 μl)的培养上清对balb/c小鼠腹腔注射进行攻毒,每组设置4只小鼠,24 h后观察小鼠死亡情况。发现当注射培养上清的剂量为20 μl时balb/c小鼠全部死亡,即绝对致死量ld为20 μl,因而确定在后续试验中每只小鼠的最佳攻毒剂量为20 μl。对照组和处理组各随机设置10只小鼠,处理组小鼠腹腔注射新鲜制备并稀释的培养上清20 μl(原液),对照组注射等体积脑心浸液培养基。在处理组小鼠出现濒临死亡状态时解剖各组小鼠,快速收集小肠(空肠)病变部位于液氮速冻后,保存于-80 ℃超低温冰箱待用。
1.2.3 总rna提取 取两组小鼠的肠道组织,使用rna提取试剂盒(rneasy mini kit,qiagen,德国),按照说明书分别提取每个样品的总rna,并通过超微量分光光度计(nanodrop 8000)检测rna的浓度及纯度,通过agilent 2100 bioanalyzer精确检测rna完整性。
1.2.4 测序及原始数据质控 每个样品构建一个文库,库检合格后,通过illumina测序平台进行测序。经过原始数据过滤、测序错误率检查、gc含量分布检查,获得后续分析使用的clean reads。并且使用hisat2软件将质控后的clean reads与参考基因组进行精确的比对,以获取reads在参考基因组上的定位信息。进而采用subread软件中的feature counts工具,根据获取的位置信息统计每个基因从起始到终止范围内覆盖的reads数。过滤掉不合格数据后进行定量分析,以及后续的差异分析和富集分析。
1.2.5 差异表达基因分析 完成基因表达定量后,通过deseq2对其表达数据进行统计学分析,筛选样本在不同状态下表达水平显著差异的基因。并且引入adj对假设检验的-value进行校正,从而控制假阳性的比例。筛选标准为| lb(foldchange)| ≥1.5,adj702 ng·μl,rin值>8.7,质量全部合格,可以正常建库(表3)。通过illumina 2000测序平台的nova-seq分别对两组样品进行测序,经过滤、整理原始数据后,共获得273 195 306条高质量数据,共计40.99 gb碱基,且每个样品的碱基量均达到6.45以上。各样品的错误率均96%,q30均>90%,gc含量均在50%左右,表明测序数据有效,可以用于后续分析。另外,6个样本与参考基因组的对比率均>92.62%,比对到参考基因组唯一位置,即用于后续定量数据分析的reads数及其百分比为77.09%~88.87%,比对到基因组外显子区域的reads数及其占clean reads数的比例为94.08%~97.70%,具体内容如表4所示。
表3 总rna质量检测table 3 examination of total rna quality
表4 转录组测序数据统计分析table 4 statistical analysis of tran ome sequencing data
2.4 差异表达基因分析与验证通过方法“1.2.5”分析比较对照组和处理组的基因表达情况,如图4a火山图所示,共得到795个差异基因,与对照组相比,处理组中有229个基因表达上调,有566个基因表达下调,有23 669个基因表达无显著性差异。为了后续进行差异基因的功能富集分析,对所有样本的基因表达值(fpkm表达矩阵)进行聚类分析,对行(row)进行均一化处理(z-score)。如图4b热图所示,表达模式相近的基因被聚集在一起,共有4个不同的功能相关类群,且每组有3个生物学重复样品间相互关联。以上结果进一步说明试验结果准确、可靠,组内不同个体的基因表达谱具有较低的变异。
a.火山图:每一个点代表一个基因,红色表示上调表达的基因,绿色表示下调表达的基因,蓝色表示非显著差异表达基因。b.热图:每列表示一个样本,每行表示一个基因;颜色代表该基因在单个样本中的表达量,红色代表表达量较高,蓝色代表表达量较低;左侧为基因聚类的树状图和子聚类的模块图a. volcano map:each dot represents a single gene. red dots represent the up-regulated genes;green dots represent the down-regulated genes;blue dots represent stably expressed genes. b. heat map:each column represents a sample and each row represents a gene. the color represents the level of the gene in a single sample, with red representing higher and blue representing lower . on the left is a dendrogram of gene clusters and a block diagram of subclusters图4 差异表达基因火山图(a)及热图(b)fig.4 volcano map (a) and heat map (b) of degs
另外,为了验证筛选后的转录组测序数据的准确性,随机挑选5个上调差异表达基因(4、、、2、4)和5个下调差异表达基因(1、186、、4、9),进行实时荧光定量pcr试验。结果如图5所示,上述所挑选的差异表达基因的q-pcr变化规律与rna-seq中表达规律一致,进一步表明所分析的数据准确可信。
图5 差异表达基因的实时荧光定量pcr验证fig.5 q-pcr verification of degs
2.5 go注释分析go(gene ontology)是描述基因功能的综合性数据库,可分为生物过程(biological process)、细胞组成(cellular component)和分子功能(molecular function)3个部分。将筛选获得的差异表达基因通过go功能富集,以校正值
C型产气荚膜梭菌外毒素致小鼠肠道损伤的转录组分析
本文2022-11-02 19:44:09发表“毕业论文”栏目。
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