杨 洋，谢黎卿，胡 沛，高丽旭，袁 祥，李 攀，彭远义，李能章

(西南大学动物医学院，重庆 400715)

多杀性巴氏杆菌是一种革兰阴性短小杆菌，自1880年巴斯德首次从患病的禽体内分离鉴定以来，发现该菌能感染几乎所有家禽、家畜及多种野生动物，引起如牛出血性败血症、猪肺疫、禽霍乱和兔巴氏杆菌病等多种动物疾病，每年给养殖业带来了巨大的经济损失。该菌也可感染人，主要通过犬猫抓咬的伤口感染，危害健康。多杀性巴氏杆菌可作为共生菌，常定植于动物口腔及鼻咽等部位，在各种应激或其他病原感染条件下大量增殖，进而侵染组织脏器引发各种疾病。

多杀性巴氏杆菌可分为5种荚膜血清型(a、b、d、e和f)和16种lps血清型，不同血清型导致的疾病特点及病理变化差异显著，各血清型间交叉免疫保护性差。当前，商品化多杀性巴氏杆菌疫苗主要针对的是牛出血性败血症、猪肺疫、禽霍乱及兔巴氏杆菌病等单一血清型感染类疾病，各疫苗间交叉保护性弱，缺乏针对多种血清型的通用型疫苗。目前，针对多杀性巴氏杆菌交叉免疫保护性疫苗的研究，主要集中在单一抗原筛选方面。

homchampa等发现，基因缺失能增强部分a型多杀性巴氏杆菌菌株的交叉免疫保护性，boyce和adler也发现，与基因缺失，均可导致b型多杀性巴氏杆菌荚膜缺失，毒力减弱及相关免疫保护特性变化。以上研究表明，多杀性巴氏杆菌某些基因的缺失能赋予缺失株交叉免疫保护特性。荚膜是多杀性巴氏杆菌重要毒力因子，与多杀性巴氏杆菌的宿主特异性、致病性、免疫保护性及感染导致的发病类型密切相关。已报道多个基因参与调控多杀性巴氏杆菌荚膜产生，但不同基因调控的荚膜缺失赋予菌株的免疫特性有很大的差异。目前研究发现的基因缺失菌株，其交叉免疫保护性并不强。本研究选择了与a型多杀性巴氏杆菌荚膜多糖合成有关的基因，通过构建缺失株及回补株，探讨该基因对多杀性巴氏杆菌的荚膜产生、生物膜形成、生长繁殖及毒力的影响，以及该基因的缺失对菌株交叉免疫保护性的影响，以期进一步为多杀性巴氏杆菌致病机制及疫苗研究奠定基础。

雌性昆明小鼠(6～8周龄，体重20～22 g)购自恩斯维尔实验动物中心，饲养及试验方式受西南大学实验动物伦理审查委员会监督(permit number: iacuc-20200803-01)。牛源a型多杀性巴氏杆菌(pmcq1、pmcq2、pmcq4、pmcq5)、牛源f型多杀性巴氏杆菌(pmf)、禽源a型多杀性巴氏杆菌(pmq)及兔源a型多杀性巴氏杆菌(pmr)均由西南大学动物医学院预防兽医学实验室分离并暂存；牛源b型多杀性巴氏杆菌(pmb，cvcc470)及猪源a型多杀性巴氏杆菌(pmp，cvcc1662)均购自中国兽医药品监察所兽医微生物菌种保藏中心；dh5α 和bl21(de3) 感受态细胞购自北京博迈德生物技术有限公司。用于基因缺失的质粒puc19orikan为实验室前期构建保藏，质粒pmc-express由四川农业大学曹三杰教授馈赠。

马丁氏肉汤培养基、脑心浸液肉汤培养基、lb肉汤培养基购自青岛海博生物技术有限公司；抗生素(卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素)、stains all粉末(7423-31-6)、结晶紫(548-62-9)及吐温20均购自上海生工生物工程股份有限公司；细菌基因组提取试剂盒(dp302-02)及反转录试剂盒(kr118-02)购自天根生物科技有限公司；限制性核酸内切酶(i、i、h i 及d iii)购自takara；in-fusionhd cloning kit (pt5162-1)购自clontech；弗氏完全及不完全佐剂购自sigma公司；羊抗鼠igg-hrp、tnf-α、ifn-γ、il-1β、il-6、il-12p40和il-17a elisa检测试剂盒购自thermo scientific公司；0.4%台盼蓝染液、tritonx-100购自solarbio；15 a vg矿物油乳化剂为重庆澳龙生物制品有限公司赠送；tmb显色液(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺)购自beyotime公司；细胞rna提取试剂盒(re-03111)购自福际生物技术有限公司；细菌rna提取试剂盒(tr214-50)购自天漠生物。

本研究选择野生株pmcq2进行基因缺失株的构建。缺失株构建采用同源重组方法，具体方法参考tatum等的研究。同源重组质粒采用实验室前期构建的多杀性巴氏杆菌基因缺失温敏型载体puc19orikan，通过温度筛选阳性克隆，最终构建无抗性marker缺失株。构建缺失株及回补株所用引物见表1。取-80 ℃ 保藏的pmcq2划线接种马丁固体平板，37 ℃ 倒置培养24 h，挑取3～4个菌落接种5 ml马丁液体培养基，37 ℃、200 r·min震荡培养8 h，离心收集菌体，提取基因组dna备用。以基因组dna为模板，分别以上、下游同源臂5′arm-f/5′arm-r和3′arm-f/3′arm-r引物扩增上、下游同源臂dna片段。以纯化的上、下游同源臂dna片段为模板，采用5′arm-f和3′arm-r引物继续进行pcr扩增，获取上下游同源臂融合dna片段，与经h i和d iii双酶切线性化的puc19orikan载体连接，连接产物转化dh5α 感受态细胞，涂布含抗生素的lb平板(kanamycin, 50 μg·ml)过夜培养，筛选获得同源臂融合dna片段重组载体。重组质粒经电转pmcq2后，涂布含100 μg·mlkan马丁氏肉汤培养基上，pcr初步筛选基因缺失菌株 Δ，进而采用qpcr及western blot 方法，从转录和蛋白水平检测 Δ中有无基因的转录表达，对验证正确的缺失菌株，连续在无抗生素的马丁肉汤培养基中传代30次，保证kan抗性消除和遗传稳定性。构建回补株时以pmc-express质粒为模板，采用引物-f/r扩增出基因表达盒，与h i和d iii双酶切线性化的puc19orikan载体连接，获得重组质粒puc19orikan-，经i和i双酶切回收骨架载体，获不含基因的线性载体puc19orikan-d备用。以pmcq2基因组dna为模板，采用com-f/r引物扩增出完整基因片段，纯化后连接到puc19orikan-d，转化dh5α 感受态细胞，筛选获得重组质粒puc19orikan-com，其后电转化 Δ感受态细胞，筛选获回补菌株c-，qpcr及western blot方法检测基因的转录表达。连续传代30次保证其遗传稳定性。

表1 基因缺失株和回补株构建所需引物table 1 primers used for the construction of mutant and complementary strains

制备hyad多克隆抗体，通过western blot方法，以此验证基因缺失株及回补株中有无hyad表达。制备方法简单来说，以pmcq2基因组dna为模板，采用wb-f/r引物扩增基因缺失部分的一个片段，扩增产物连接到pet32a(+)，转化dh5α感受态细胞，筛选获得的重组质粒继续转化.bl21(de3) 感受态细胞，阳性克隆按照实验室前期方法进行蛋白诱导表达和纯化。纯化的重组蛋白与弗氏完全佐剂按照1∶1比例充分乳化混合，重组蛋白终浓度为0.5 μg·μl。小鼠背部皮下多点免疫(100 μl乳化液·只)，首免后14 d加强免疫1次，重组蛋白免疫量与首免一致，但佐剂为弗氏不完全佐剂；二免后14 d 尾静脉采血，分离血清备用。

取-80 ℃ 保藏的pmcq2、Δ、c-分别划线接种马丁固体平板，37 ℃ 倒置培养24 h，挑取3～4个菌落接种5 ml马丁液体培养基，37 ℃、220 r·min震荡培养10 h。菌液稀释平板计数后，采用马丁氏肉汤培养基稀释各菌株培养液含菌量至2×10cfu·ml，其后按1∶100接种量转接5 ml新鲜马丁氏肉汤培养基，37 ℃、220 r·min震荡培养，每隔2 h取样测定od值，取8个时间点，绘制生长曲线。试验每次设3个生物重复，重复3次。

荚膜多糖测定方法参照chung等的研究。分别取1 ml pmcq2、Δ及c-对数生长期培养液，13 000 r·min离心10 min，去上清，菌体用pbs 洗涤2次，其后用1 ml pbs重悬菌体，42 ℃处理1 h(处理前后分别取5 μl进行平板计数)，菌悬液13 000 r·min离心10 min，取100 μl上清液，加入900 μl荚膜染色液(0.2 mg·ml的stains all粉末、50%甲酰胺和0.6%冰醋酸)振荡混匀，同时配制透明质酸标准曲线溶液样品(0、0.5、1、2、3、4、5 μg·(100 μl)透明质酸分别加入900 μl荚膜染色液)，采用酶标仪测定od值，根据标准曲线计算各菌株细胞荚膜含量。试验每次设5个生物重复，重复3次。

生物膜测定参考jin等的研究方法。取平板计数后的pmcq2、Δ及c-对数生长期培养液，用脑心浸液肉汤(bhi)培养基稀释至菌含量为1×10cfu·ml，取稀释菌液至48孔细胞培养板(400 μl·孔)，阴性对照为400 μl bhi肉汤培养基，混匀置37 ℃ 恒温培养48 h。去培养液，pbs(200 μl·孔)轻柔清洗2次，室温干燥，每孔加入200 μl甲醇室温固定1 h，pbs轻柔清洗3次，室温干燥，加入1 %结晶紫(200 μl·孔)，37 ℃ 染色30 min，pbs轻柔清洗3次，室温晾干，最后加入33% 冰醋酸溶液(200 μl·孔)，37 ℃ 溶解30 min，采用酶标仪测定od值。试验每次设5个生物重复，重复3次。

取马丁肉汤培养至对数生长期的Δ和c-平板计数后，按Δ(1.7×10、1.7×10、1.7×10、1.7×10、1.7×10cfu)和c-(3.4×10、3.4×10、3.4×10、3.4×10、3.4×10cfu)各5个梯度的菌，分别采用肌肉途径攻毒小鼠(=10)，连续观察1周。当小鼠濒临死亡时(精神沉郁、闭眼、食欲断绝、外界刺激反应弱等)，实施安乐死，统计小鼠死亡数，采用bliss法计算半数致死量。

分别取2.0×10cfu对数生长期pmcq2、Δ及c-，左后腿肌肉途径感染小鼠(=6)。攻毒后8、24 h分别取6只小鼠安乐死，采集肺、肝和脾称量、匀浆、稀释涂马丁固体平板，检测其含菌量。采集小鼠感染24 h肺，多聚甲醛固定后送里来佳诺生物科技有限公司做病理切片，he染色分析。

本细胞试验主要分析野生株pmcq2、Δ及 c-对小鼠腹腔巨噬细胞的黏附、抗吞噬及促炎能力的差异。方法参照实验室前期研究。无菌采集小鼠腹腔巨噬细胞，制备成细胞悬液后按照1∶4的比例与0.4%的台盼蓝混合，细胞计数板计数后铺于48孔细胞板(2×10细胞·孔)，置37 ℃、5% co培养箱中，贴壁2 h后，去未贴壁细胞，添加新细胞培养液，取对数生长期pmcq2、Δ及 c-经马丁肉汤平板计数后，按1 moi(multiplicity of infection)感染细胞，感染8 h后，去培养液，pbs清洗3次。每个菌取一半感染孔，分别加入100 μg·ml环丙沙星(500 μl·孔)处理30 min(杀死细胞外的菌，包括黏附菌)，pbs洗涤3次；另一半感染孔不加抗生素处理。其后，所有感染孔，每孔加入500 μl含0.1% tritonx-100的pbs溶液，充分裂解细胞，释放出细胞中被吞噬细菌。取细胞裂解液分别进行平板菌落计数，测定各菌黏附的菌数及被细胞吞噬的菌数。试验每次设5个生物重复，重复3次。

取6孔细胞板，每孔接种2×10个巨噬细胞，贴壁2 h后，分别感染1 moi对数生长期pmcq2、Δ及c-，感染8 h后，收集培养液，4 ℃、13 000 r·min离心10 min，取上清液，采用elisa检测试剂盒，分别检测上清中tnf-α、il-1β、il-6、il-12p40和il-17a等炎性因子。与此同时，收集各菌感染的巨噬细胞，提取总rna，采用qrt-pcr方法，分别测定各菌感染的巨噬细胞中-、-1β、-6、-12p40和-17a等基因的转录情况。

为分析hyad参与调控其他基因表达情况，在此调查了其对菌株荚膜及生物膜产生、lps合成及转运、铁转运相关及保护性抗原等相关基因表达的影响。分别取pmcq2、Δ及c-菌株对数生长期培养液，4 ℃、13 200 r·min离心2 min，收集菌体，采用细菌rna提取试剂盒提取总rna，反转录合成cdna。相关检测基因及引物见表2，qrt-pcr方法检测各基因的表达。试验设5个生物重复。

表2 qrt-pcr检测基因所需引物table 2 primers required for gene detection by qrt-pcr

灭活菌苗制备方法参考试验前期研究。取pmcq2株和Δ株种子液，按 1% 分别接种马丁肉汤培养基，37 ℃、220 r·min恒温震荡培养12 h，对培养后的pmcq2株和Δ株菌液，分别进行纯粹性检验和活菌计数后浓缩，浓缩后分别加入终浓度为0.15% 的甲醛溶液，37 ℃ 静置灭活24 h，期间每隔3 h适当振荡使其充分灭活，其后，两种菌各取100 μl处理液，分别涂布于马丁固体培养基上，于37 ℃ 培养24 h 进行灭活检验。灭活检验合格后，将菌液和pbs分别与15 a vg矿物油佐剂按照4∶1体积比混合均匀，分别制成灭活菌苗和pbs乳化剂，使pmcq2株和Δ株终浓度均为5×10cfu·ml。每种灭活苗各取100 μl涂布在马丁固体平板上，于37 ℃ 培养24 h 进行无活菌检验。另选取6只小鼠，分别背部皮下接种100 μl灭活苗进行疫苗安全性评价。检验合格疫苗4 ℃ 保存备用。

取雌性昆明小鼠(6～8周龄，体重20～22 g)270只，随机分为27组，每组10只。按照表3进行疫苗免疫及攻毒分组。其中pmcq2(1-9)、Δ(1-9)和pbs emulsifier(1-9)各为9个组。小鼠背部皮下多点注射疫苗，共免疫2次，首免后第14天进行加强免疫。首免第21天，分别以3.6×10cfu pmcq1(ld=3.8×10cfu)、3.2×10cfu pmcq2 (ld=3.43×10cfu)、4.6×10cfu pmcq4(ld=2.1×10cfu)、2.9×10cfu pmcq5 (ld=4.5×10cfu)、1.2×10cfu pmb (ld=5.0×10cfu)、4.4×10cfu pmf(ld=1.0×10cfu)、10 cfu pmq (ld≈1 cfu)、10 cfu pmp (ld≈1 cfu)、2.2×10cfu pmr (ld=1.0×10cfu)等9株菌肌肉攻毒，攻毒后每天观察2次，记录小鼠临床症状，濒临死亡实施安乐死，记录小鼠死亡数量，连续记录1周。疫苗保护率按以下公式计算：保护率(%)=(对照组死亡率-免疫组死亡率)/对照组死亡率×100。

表3 免疫分组和攻毒设计table 3 immunization grouping and challenge design

参照“1.13”小鼠免疫分组，共设定2个疫苗免疫组(pmcq2及Δ)及1个pbs乳化剂免疫对照组和1个未免疫的空白对照组，每组6只小鼠，免疫方式及剂量参见表3，初免21 d尾静脉采血，分离血清，elisa方法检测疫苗免疫各组特异性抗体水平(包被抗原分别为pmcq1、pmcq2、pmcq4、pmcq5、pmb、pmf、pmp、pmq和pmr全菌蛋白)。

参照“1.13”小鼠免疫分组，设定2个疫苗免疫大组，pmcq2(1-10)及Δ(1-10)，每种疫苗分为10个小组，每小组3只小鼠，免疫方式及剂量参见表3，初免第21天，其中9组分别感染pmcq1、pmcq2、pmcq4、pmcq5、pmb、pmf、pmp、pmq、pmr等9种菌，感染剂量参照“1.13”，余下1组作未感染组对照。感染12 h后，所有小鼠实施安乐死，取肺组织送里来佳诺生物科技有限公司制做病理切片，he染色分析。

采用graphpad prism 6软件进行试验数据分析处理，检验分析，>0.05为无显著差异；