臧江华，安一娜，王 婧，王科智，杨静静，高 敏，冯岚迪，谭姝瑜，胡艳欣，董彦君

(中国农业大学动物医学院，北京 100193)

产气荚膜梭菌(，cp)是革兰阳性、产芽胞的厌氧性杆菌，普遍存在于鸡料槽、粪便、污水、土壤以及健康鸡的肠道中，是鸡坏死性肠炎(necrotizing enteritis，ne)的主要致病菌。依据cp分泌的四种主要毒素α、β、ε、τ，可将cp分为a～e共5种血清型，大规模流行的为a型。ne以肠道严重出血，肠黏膜严重损伤、溃疡和坏死为特征，是家禽养殖业危害最大的疾病之一，每年给养禽业造成巨大经济损失。对于ne的防控，我国养殖业主要通过在饲料或饮水中添加抗生素来预防和治疗cp感染。青霉素、阿维拉霉素、四环素、泰乐菌素、林可霉素、杆菌肽等几种抗生素较常用，且疗效较好。然而抗生素的滥用也使得越来越多的cp产生了耐药性，药效明显降低。近年来，抗生素被禁止作为抗生素促生长剂后，鸡ne的发病率急剧上升。我国已于2020年开始全面实施禁抗措施。目前，全面禁抗后，临床上流行的菌株对常用药物的敏感性有无发生变化还不清楚，常用药物的防治效果需要进一步调查。本文研究了有ne发病史的规模化肉鸡养殖场内cp分离株的毒素型、致病力以及它们对临床上常用3种药物阿维拉霉素、泰乐菌素和林可霉素的敏感性，并根据药敏结果选定阿维拉霉素和磷酸泰乐菌素对ne发病鸡场的无症状鸡群进行预防试验，评价药物效果，从而为规模化养殖场由cp引起的ne防治提供指导。

1.1.1 药物 盐酸林可霉素、磷酸泰乐菌素、阿维拉霉素、阿维拉霉素预混剂、磷酸泰乐菌素预混剂，来自中国农业大学动物医学院兽医药理毒理学实验室。

1.1.2 菌株 鸡源a型产气荚膜梭菌(c57-85)cvcc2030、鸡源c型产气荚膜梭菌(c59-2)cvcc60102，购自中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心；脆弱拟杆菌atcc25285，购自美国模式菌种收集中心(atcc)。

1.1.3 主要培养基与耗材 液体硫乙醇酸盐(ftg)培养基、 胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸(tsc)琼脂、脑心浸液琼脂(bha)培养基、无菌脱纤维羊血均购自北京陆桥技术股份有限公司，chromagar沙门氏菌显色培养基、mh液体培养基购自北京普纳德科技有限公司，2.5 l厌氧培养包购自日本三菱瓦斯化学株式会社，美蓝染色液购自青岛海博生物技术有限公司。

1.1.4 主要仪器设备 恒温培养箱，上海一恒科技有限公司产品。密封培养罐，美国thermo公司产品。spf鸡隔离器，苏州市冯氏实验动物设备有限公司产品。pcr 扩增仪，电泳成套设备，凝胶成像系统，美国 bio-rad 公司产品。

1.2.1 样品采集、cp的分离、毒素型鉴定 2019、2020年，于山西、河北两地有ne发生的规模化养殖场进行采样，使用微生物采样管采集肉鸡肛门或泄殖腔内新鲜粪便，置于4 ℃低温保存箱中带回实验室。将粪样放入ftg内增菌，吸取增菌液与50 ℃左右的 tsc 琼脂混匀，凝固后再倒一层tsc，再次凝固后，置于密封培养罐内，放入2袋厌氧培养包，合上盖子密闭，37 ℃培养 24 h。挑取cp单菌落在绵羊血琼脂平板上划线置于放有厌氧产气袋的密封培养罐内37 ℃培养24 h。将疑似cp的分离株送去测序公司进行16s rrna测序，鉴定细菌种属。合成 cpa、cpb、etx、iap引物，通过多重pcr方法进行毒素型鉴定。

1.2.2 cp的致病力试验 在中国农业大学实验动物平台隔离器中，使用spf鸡开展试验。购入60只1日龄鸡(记为d1)进行前期饲养，正常雏鸡料饲养至12日龄，在d12将试验鸡随机分配到4组(a、b、c、d组)，每组15只，更换为50%鱼粉+50%燕麦粉饲喂。培养3株临床分离株(菌株20hb6rk39、20sj5rx172、20sj5rx66，分别对应a组、b组和c组)，d14日分别对a、b、c组试验鸡进行攻菌，每只鸡经灌胃感染1 ml 1×10cfu·ml的菌液，连续攻菌5 d，分别在dm(攻菌结束次日)、dm+7、dm+14日剖杀5只鸡进行剖检并按liu等的0～4分评分系统进行肠道病变评分，0分正常，4分最严重。无菌采取回肠内容物，按“1.2.1”的方法检测cp，用接种环蘸取适量回肠内容物，在chromagar沙门菌显色培养基平板上划线，37 ℃培养24 h，检测沙门菌，将紫色菌落转接到mh液体培养基中进行纯培养后pcr扩增并测序，鉴定是否为沙门菌。用接种环蘸取回肠内容物在载玻片上涂片，用美蓝进行染色，在显微镜下观查是否有球虫卵囊。在dm～dm+14期间每日观察各组鸡群主要临床症状，对并精神食欲和腹泻症状进行评分。记录死亡鸡数。菌株致病有效性评估主要指标为dm+7日出现明显ne病变，即各组鸡群有50%的鸡出现死亡或有ne临床症状或有剖检鸡肠道存在ne病变且剖检鸡回肠内容物均检出cp。

1.2.3 最小抑菌浓度(mic)测定先将阿维拉霉素、林可霉素、泰乐菌素药物贮备液(初始浓度)用ftg培养基进行连续的二倍倍比稀释，将稀释后的药液各取100 μl，按照浓度由高至低依次加到微孔板的第1～11孔，每孔对应浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg·ml。在第12孔加100 μl不含药物的ftg培养基，作为阴性对照孔；在96孔板的第h11孔、h12孔加200 μl不含药物不含菌的ftg培养基，作为阳性对照孔。用ftg增菌至菌液浊度达到0.5麦氏浊度(10cfu·ml)，再稀释至到5×10cfu·ml，作为测试菌液。分别吸取100 μl测试菌液加到微孔板第1～12孔中，微孔板加盖并用胶带固定，37 ℃厌氧培养24 h。第1～11孔对应药液终浓度由高至低分别变为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg·ml。每批药敏试验均用脆弱拟杆菌标准株(atcc25285)作为质量控制对照。当阴性对照孔没有细菌生长、阳性对照孔有细菌生长，加药无细菌生长孔的最低浓度即为药物对测试菌株的mic。

1.2.4 预防效果试验 在确诊某肉鸡场正在发生由cp引起ne的鸡群中，遴选132只无ne症状鸡，转入隔离舍开展试验，记为d0日。将132只无ne症状鸡随机分配到3个组(pa、pb和pc)组，每组44只鸡，开展试验。从d1日开始，pa组饲喂含有阿维拉霉素预混剂30 g·t(以阿维拉霉素含量计)的饲料，连续21 d；pb组饲喂含有磷酸泰乐菌素预混剂100 g·t(以磷酸泰乐菌素含量计)的饲料，连续7 d；pc组饲喂正常饲料。每日观察鸡临床症状并评分，包括精神食欲(0分：活泼好动，反应敏捷，食欲旺盛；1分：反应变慢，羽毛松乱，离群呆立，食欲减退；2分：精神萎顿，反应迟钝，翅膀下垂，食欲严重下降；3分：趴卧不起，食欲废绝)和腹泻症状(0分：排浅灰绿色柔软柱状粪便，表面有少量白色尿酸盐；1分：排黄白色稀粪，有未消化饲料，肛周有粪污；2分：排黄褐色水样臭粪； 3分：排红色、黑褐色粪便，混有血液和肠黏膜组织)。分别在d0、d7、d21、d28每组选11只鸡剖检，对肠道病变进行评分，并收集回肠内容物进行病原检测。试验结束后，按检测时间节点(d0、d7、d21、d28)和试验阶段(d0～d7、d8～d21、d22～d28)收集整理数据，用spss对数据进行方差分析。以肠道ne病变发生率、cp检出率为主要指标，以肠道ne病变评分、精神食欲和腹泻症状评分为次要指标，评估用药磷酸泰乐菌素预混剂7 d和阿维拉霉素预混剂21 d对预防肉鸡ne的有效性。

在河北省保定市2个肉鸡养殖场、山西省晋中市1个肉鸡养殖场、山西省晋城市1个肉鸡养殖场共收集753份泄殖腔拭子，分离到91株cp，分离率为12%。cp在tsc平板上为中心黑色的菌落。在绵羊血琼脂平板上生长的菌落为圆形、边缘整齐、凸起、表面光泽、半透明的菌落，周围形成双层溶血环，内层溶血环明显。挑选12株分离的cp进行16s rrna测序，结果显示分离株与标准菌株c57-85 60102的相似性高达99%，表明分离菌株是cp。多重pcr方法测得，91株cp均只扩增出一条约324 bp的dna条带，如图1，结果显示，91株cp均为a型，无其他毒素型。

m. dna相对分子质量标准；1. a型菌标准菌株；2. c型菌标准菌株；3. 阴性；4～7. 样品m. dna marker; 1. standard strain of type a bacteria; 2. standard strain of type c bacteria; 3. negative; 4-7. samples图1 产气荚膜梭菌毒力基因的多重pcr检测fig.1 multiplex pcr detection of virulence genes in c. perfringence

cp经灌胃感染spf鸡，观察ne病变，从而验证cp致病力。肠道剖检显示，在dm、dm+7和dm+14 d，攻毒组与未攻毒组相比，ne病变评分和ne发生率均有显著上升(128 μg·ml。磷酸泰乐菌素的mic范围为0.25～32 μg·ml，mic为0.5 μg·ml，mic为8 μg·ml。

在确定菌株对药物敏感性后，选用阿维拉霉素预混剂和磷酸泰乐菌素预混剂进行临床预防效果试验。

2.4.1 ne病变发生率 在d0、d7、d21、d28时，各组选择11只鸡进行剖检，观察肠道ne病变情况。统计剖检鸡的ne病变发生率，结果见表1， 与对照组相比，pa组的ne病变发生率在d21和d28时均显著低于pc组(0.05)。对照组的ne病变发生率在d0、d7、d21逐渐升高，在d21时到达最高81.2%，并且与d0时相比有显著差异(0.05)。各组鸡在d0、d7、d21、d28日均只有个别鸡出现腹泻，组别之间无显著差异(>0.05)。因此，精神食欲和腹泻症状各组之间无显著差异。

2.4.4 ne病变评分 在d0、d7、d21、d28日，各组剖杀11只鸡观察肠道病变，cp对十二指肠、空肠、回肠的损伤最为明显，可形成明显的坏死点。如图2所示，与对照组相比，pa组在d7日、d21、d28日均未见明显的出血点，pc组可见随着时间延长，小肠内壁的出血点明显增多，甚至出现融合性坏死。pb组小肠在d7日时无明显坏死点，但是d21、d28日也逐渐出现坏死点，但明显不如pc组严重。

图2 d7、d21、d28日各组鸡小肠肠道病变fig.2 intestinal lesions in each group on d7, d21 and d28

统计各组剖检鸡的ne病变评分，见表3。与对照组相比，pa组的平均ne病变评分在d7、d21和d28时均显著低于pc组(