肖 园，吕艳丽,2*，孙艳争,2*

(1.中国农业大学动物医院，北京 100193； 2.中国农业大学动物医学院，北京 100193)

犬呼吸道冠状病毒(canine respiratory coronavirus，crcov)首次发现于2003年英国的某家大型流浪动物中心，crcov与犬肠道冠状病毒(canine coronavirus，ccov，属于α冠状病毒属)的同源性低(在稳定的聚合酶基因上的核苷酸相似性仅为69%，而在可变区的氨基酸序列相似性仅为21%)，但与牛冠状病毒同源性很高(90%以上)，因此被归类于β冠状病毒属。crcov主要侵害犬的呼吸道，尤其是咽扁桃体和气管。单独感染通常只引起轻度的呼吸道症状，如喷嚏、鼻流分泌物和干咳等。免疫力强的犬也可能表现为无呼吸道症状。该病的潜伏期为6～10 d，感染后6 d可通过口咽途径排毒。迄今为止，尚无针对crcov感染的特异性疗法及针对该病毒的疫苗。

crcov在全球范围内多个国家和地区广泛流行，但国内的流行性研究报道较少。临床上，crcov还可与其他呼吸道病原体发生混合感染，这可能对犬类造成较为严重的健康威胁。本研究对crcov进行流行病学、致病特点等方面的调查，以期对crcov有更为深入的了解，从而有利于对犬传染性呼吸道疾病进行防治，保障动物健康。

2015年12月—2017年3月，于中国农业大学动物医院收集的487份犬咽鼻拭子。

病毒基因组dna/rna快速提取试剂盒ii购自北京艾德莱生物科技有限公司。amv reverse tran ase反转录试剂购自promega公司(usa)。2×taq pcr mastermix试剂购自北京康润诚业生物科技有限公司。琼脂糖购自 biowest(西班牙)。goldview核酸染料购自北京赛百盛基因技术有限公司。pcr引物及pcr产物序列测定由三博生物工程技术有限公司完成。采用primerpremier 5.0软件设计引物。

1.2.1 crcov rt-pcr检测方法的建立和临床样本的检测 ①引物：选择erles 等检测crcov所使用的巢式引物，经生物学软件primer评估合格后进行合成。扩增序列位于基因，引物序列及扩增片段长度见表1。②核酸提取及pcr扩增：按照rna提取试剂盒说明提取鼻咽拭子样本中的总rna，使用反转录试剂进行rna反转录，然后利用巢式pcr检测方法对crcov目的片段进行特异性扩增。扩增分为两步，第一步以反转录获得的dna为模板，使用外围引物(crcov no-up, crcov no-down)进行crcov特异性pcr扩增；第二步以上述pcr产物为模板，用内围引物(crcov ni-up, crcov ni-down)进行crcov特异性pcr扩增。③凝胶电泳及成像：将pcr扩增产物加入1%琼脂糖凝胶中进行电泳，利用sim成像系统进行观察，保存图像并记录试验结果。将阳性扩增产物送至三博生物工程技术有限公司进行进行序列测定和分析，并将测序鉴定结果为crcov阳性的样本于-20 ℃保存，作为阳性质控。

表1 crcov检测用pcr引物table 1 pcr primer for detecting crcov

此crcov巢式pcr方法验证成功后，收集有或无临床症状的临床样本进行crcov检测并记录检测结果，用于后续分析。

1.2.2 犬腺病毒ii型、犬副流感病毒和犬瘟热病毒pcr/rt-pcr检测 采用本实验室已经建立的犬腺病毒ii型(canine adenovirus type 2，cav-2)、犬副流感病毒(canine parainfluenza virus，cpiv)和犬瘟热病毒(canine distemper virus，cdv)的pcr/rt-pcr检测方法对部分样本进行检测，所用引物见表2。阳性质控品为硕腾卫佳伍疫苗。cpiv、cav-2和cdv的检测用引物序列及扩增片段长度见表2。

表2 cpiv、cav-2、cdv检测用pcr引物table 2 pcr primer for detecting cpiv, cav-2, cdv

1.2.3 统计分析 利用microsoft excel 2007软件进行数据录入、整理和分析。本试验中涉及的分类资料间的差异性情况通过卡方检验进行比较，通过回归统计对crcov感染率与年龄的关系进行分析。0.05)，即北京地区crcov与cpiv、cdv、cav-2的混合感染率和德国基本相同。

为研究crcov的致病力强弱，将crcov感染犬的症状分为三类进行分析。从表6来看，呈中至重度呼吸道症状的crcov感染犬有100.00%混合感染了其他呼吸道病毒，且这2例犬均混合感染了致病力强的cdv，故不能说明crcov致病力强。而呈无呼吸道症状和轻度呼吸道症状的crcov感染犬的混合感染率相对较低，分别为12.50%(1/8)和41.18%(7/17)，且所有crcov感染犬有93.75%(90/96)表现无呼吸道症状及轻度呼吸道症状，无呼吸道症状的crcov感染犬占所有无呼吸道症状犬的比例较高(27.19%，表5)，这说明crcov单一感染多表现为无呼吸道症状或轻度呼吸道症状，crcov对呼吸系统的致病力较弱。

从表6来看，crcov感染混合感染其他呼吸道病毒(cpiv/cdv/cav-2)的患犬共10只，多表现轻度呼吸道症状(70.00%)，其次是中至重度呼吸道症状(20.00%)，较少表现为无呼吸道症状(10.00%)。

北京地区crcov的分子流行率较高，在冬春季节更易流行，且各年龄段犬的检出率差异不显著。该病毒与cpiv、cav-2、cdv的混合感染率较低。该病毒的致病力较弱，感染犬通常无呼吸道症状或表现轻度呼吸道症状。