刘 健，白艺兰，李 鑫，桂亚萍，鞠厚斌，龚国华，夏炉明，陈伟锋，朱晓英，常晓静，李增强，唐聪圣，王 建，赵洪进

(上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103)

猫杯状病毒(feline calicivirus，fcv)属于杯状病毒科、水疱疹病毒属，是一种引起猫科动物口腔与上呼吸道疾病的重要病原。fcv呈世界性分布，在猫科动物中具有高度传染性，猫及老虎、猎豹等野生猫科动物均易感。fcv主要临床症状表现为鼻炎、结膜炎、急性口腔溃、肺炎、慢性胃炎和跛行等。近年来，由于fcv高度的变异性产生的强毒株可引起严重、急性、致死性全身性疾病，死亡率高达50%，症状可表现为溃疡性皮炎、急性关节炎、肠炎、流产以及跛行等全身感染，对猫及猫科动物造成严重威胁。

fcv全基因组由3个开放性阅读框(open reading ，orf)组成，其中，orf2基因编码结构蛋白1，按功能域orf2又可划分为a、b、c、d、e和f 6个区。c和e区变异性较大，特别是e区包含鉴别vs-fcv的特征性氨基酸突变位点，变异最为明显，也是早期疫苗免疫失败的重要原因。为了进一步了解fcv在上海地区流行状况及其遗传变异和演化方向，本研究从2021年1月—3月，从上海地区上呼吸道症状猫的病料中分离鉴定得到13株fcv，对其1基因进行遗传演化分析，丰富了国内fcv分离株的基础数据，也为该病毒强毒株的筛选和疫苗研究提供参考依据。

从上海市中心城区宠物医院收集了17份具有上呼吸道症状患猫的眼结膜、口咽和鼻黏膜拭子样品，记录患猫的年龄、猫三联灭活疫苗免疫情况、主要临床症状(表1)。将采集的拭子加2 ml pbs缓冲液浸泡后，用0.22 μm微孔滤膜过滤，-20 ℃保存备用。

表1 临床样品采集的详细信息table 1 details of the clinical samples

f81细胞(猫肾传代细胞)由上海市动物疫病预防控制中心兽医实验室保存。猫三联灭活疫苗(猫鼻气管炎、嵌杯病毒病、泛白细胞减少症)(批号：d286389a)购自硕腾(上海)企业管理有限公司；dmem细胞培养液(批号：2126865)、0.25%浓度胰酶消化液(批号：2042303)均购自gibco公司；胎牛血清(批号：2418)购自sigma公司；核酸提取试剂盒(批号：mdii14-01)购自magen公司；prime rt-pcr kit(批号：aj62323a)、la pcrkit ver.2.1(批号：ak5301)、prime one step rt-pcr kit ver.2(dye plus)(批号：ake0559a)购自宝生物工程(大连)公司；猫疱疹病毒1型荧光pcr检测试剂盒(批号：fhv20210504)、猫细小病毒荧光pcr检测试剂盒(批号：fpv20210604)购自上海尔创生物科技有限公司。

吸取50 μl上述处理的样品，猫三联灭活疫苗作阳性对照，阴性拭子作阴性对照，提取总rna，依据参照文献[6]合成引物：上游引物fcv-jcf：5′-gcctcaaacattaggagtgc-3′；下游引物fcv-jcr：5′-ccctggggttaggcgcag-3′，扩增片段为420 bp，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。按照文献[6]的方法进行rt-pcr扩增，1%琼脂糖凝胶电泳分析，将出现预期目的片段的rt-pcr产物送上海桑尼生物科技有限公司进行测序，测序结果用ncbi中的blast工具进行比对分析，确认是否为fcv基因序列。同时将fcv阳性的样本接种f81细胞，进行病毒的分离培养。

f81细胞常规消化传代，待长成单层且贴壁率达到90%时，将细胞按照1∶3的比例消化传代，同时将上述病料同步接种到细胞中，37 ℃，5% co浓度培养箱中培养，每6 h观察细胞病变1次，70%细胞出现细胞病变、圆缩和脱落时，将培养液冻融3次，收集细胞上清。

1.5.1 fcv1基因的扩增 依据参考文献[4]合成fcv1基因全长扩增引物，fcv-vp1上游引物：5′-atgtgctcaacctgcgc-3′；fcv-vp1下游引物：5′-tcataatttagtcattgagctcct-3′。fcv1基因序列全长2 007～2 010 bp，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。体系总体积为50 μl：prime rt-pcr kit buffer 25 μl，enzyme mix 2 μl，上、下游引物(浓度均为10 μmol·l)各1 μl，rna模板1 μl，双蒸水补至50 μl。反应条件：50 ℃反转录30 min；94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃ 保存。取5 μl rt-pcr扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性rt-pcr产物送上海桑尼生物科技有限公司进行测序。测序结果用ncbi中的blast工具进行比对分析，确认是否为fcv的1基因序列。

1.5.2 形态学鉴定 将分离病毒株第3代培养物接种f81细胞，待70%细胞出现cpe后反复冻融3次收毒，将收获的细胞液冻融3次后，10 000 r·min离心1 h，除去细胞碎片，随后上清液与终浓度为10%的聚乙二醇8000(peg8000)混合过夜。在4 ℃下12 000 r·min离心2 h后，用tris缓冲盐溶液(tbs)重悬，经2%磷钨酸负染后进行透射电镜观察。

1.5.3 外源病毒检测 对13株分离株进行猫疱疹病毒1型(fhv-1)和猫细小病毒(fpv)两种外源病毒检测。根据猫疱疹病毒1型荧光pcr检测试剂盒和猫细小病毒荧光pcr检测试剂盒要求，对分离病毒株第3代培养物进行fhv-1和fpv荧光pcr检测。

分别参照国内外fcv强毒株、经典株和疫苗株1基因序列(表2)，利用mega 6.0和dnastar v7.1软件构建fcv1基因遗传演化分析树，并分析其序列特征。

表2 fcv vp1参考序列table 2 reference strains of fcv vp1 gene

1.7.1 分离株有限稀释纯化 将fcv-sh202101和fcv-sh202113分离病毒株第3代培养物用细胞培养液进行10倍的倍比稀释，共稀释11个稀释度，将稀释液与消化好的细胞悬液按照体积比1∶3加入至6孔板中，第12孔加细胞悬液作阴性对照，每孔体积为2 ml。37 ℃，5% co浓度培养箱中培养，每6 h观察细胞病变1次。待70%细胞出现细胞病变、圆缩和脱落时，收获出现细胞病变的最大稀释度孔的上清进行二次有限稀释纯化，共稀释纯化6次，测定纯化后病毒液的tcid，-80 ℃保存备用。

1.7.2 攻毒试验 将6只健康中华田园猫(3只2～3月龄幼猫，3只2岁左右成年猫，均未免疫过猫三联灭活疫苗)分为a组、b组和对照组，每组均为2只，包括1只幼猫和1只成年猫。a和b 组猫均采用滴鼻和口服方式分别接种10tcid·ml的fcv-sh202101和10tcid·ml的fcv-sh202113分离株病毒液，接种剂量为滴鼻和口服各1 ml·只；对照组猫接种相同剂量的dmem细胞培养液。不同感染组隔离饲养，自由采食、饮水，每日监测猫的临床症状和死亡情况，同时采集眼、口、鼻拭子用于排毒情况的检测。

17份病料经fcv rt-pcr扩增，其中，编号为bd20210104-2～bd20210104-8、bd20210112-1、bd20210127-1、bd20210804-1、bd20210804-3～bd20210804-5的13份样品扩增产物经凝胶电泳检测显示，在420 bp左右出现与预期目的产物大小一致的目的条带，部分病料样品的扩增结果见图1。

m. dl2000 dna相对分子质量标准；1～4. rt-pcr阳性病料样本；5～8. rt-pcr阴性病料样本；9. 阳性对照；10. 阴性对照m. dl2000 dna marker; 1-4. rt-pcr positive samples; 5-8. rt-pcr negative samples; 9. positive control; 10. negative control图1 部分病料fcv rt-pcr检测结果fig.1 fcv rt-pcr detecting results of part samples

将13份样品的rt-pcr产物进行测序，测序结果在ncbi中进行blast比对分析，确认13个序列均为fcv的基因序列，表明13份样品均为fcv阳性。

13份fcv阳性病料接种f81细胞，盲传3代，第3代细胞培养物接种f81细胞24 h，均产生cpe，细胞出现圆缩、拉丝、聚集现象，然后脱落、漂浮在细胞维持液中(图2)。

a.接种bd20210104-2第3代细胞培养物的f81细胞；b.阴性对照a. f81cells inoculated the 3rd generation cell culture of bd20210104-2; b. negative control图2 接种bd20210104-2第3代细胞培养物24 h后f81细胞病变结果fig.2 cpe of the 3rd generation cell culture of bd20210104-2 in f81 cells at 24 h

将13份病毒上清液提取rna，进行fcv1 rt-pcr扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测后得到约2 000 bp大小的条带，与预期2 007 bp大小一致(图3)。测序结果拼接后，得到13株fcv的1全基因序列，将13株病毒1基因序列在ncbi中进行blast比对分析，确认13株序列均为fcv的1基因序列，表明13株分离株为fcv，分别命名为fcv-sh202101～fcv-sh202113。

m. dl2000 dna相对分子质量标准；1～13. fcv vp1 rt- pcr阳性产物m. dl2000 dna marker; 1-13. fcv vp1 rt- pcr positive products图3 fcv vp1 rt-pcr结果fig.3 fcv vp1 rt-pcr detecting results

fcv-sh202101株f81细胞第4代培养物经电镜负染观察可见无囊膜，呈圆形、椭圆形等形态，直径30～40 nm的病毒粒子(图4)，与杯状病毒粒子形态特征相符，表明分离株病毒为fcv。

图4 fcv-sh202101病毒粒子电镜图fig.4 electron microscopy image of isolated fcv-sh202101 strain

对13株fcv分离株进行fhv-1和fpv两种外源病毒荧光pcr检测，结果均为阴性。

2.6.1 分离株与国内外参考株1基因同源性及遗传演化分析 将13株fcv分离株与国内外参考株1基因进行同源性分析。结果显示，13株上海分离株之间的核苷酸序列相似性为74.3%～99.8%，其中，fcv-sh202103株与fcv-sh202104株相似性最高，为99.8%；fcv-sh202108株与 fcv-sh202111株相似性最低，为74.3%。与国内外强毒株相似性为73.8%～82.9%，其中，fcv-sh202113株与fcv-5株相似性最高，为82.9%；与国内外经典株相似性为73.4%～80.1%，氨基酸序列分析显示，fcv-sh202102株与fcv-yh-16株的相似性高达91.9%，fcv-sh202108株与fb-nj-13株的相似性最低，为82.1%；与疫苗株相似性为73.2%～79.8%，氨基酸相似性fcv-sh202103株与f4株高达89.4%，fcv-sh202102株与f4株最低，为82.7%。

遗传演化树分析显示，13株分离株分布于3个分支，fcv-sh202108株与上海分离株sh/2014遗传关系较近，fcv-sh202103、fcv-sh202104和fcv-sh202112遗传关系较近，与国外参考株和疫苗株处于同一分支；fcv-sh202113株与强毒株fcv-5遗传关系较近，处于同一分支；其余毒株与国内参考株处于同一分支，且fcv-sh202101、fcv-sh202102、fcv-sh202106、fcv-sh202107、fcv-sh202109和fcv-sh202110遗传关系较近(图5)。

▲表示分离毒株▲stands for isolated strain图5 分离株与参考株vp1基因序列遗传演化树fig.5 maximum-likelihood tree d on vp1 gene of isolated strains and reference strains

2.6.2 vs-fcv特征性氨基酸分析 以部分e区(426—461 aa)分析的具有vs-fcv突变特征氨基酸位点为依据，确定430、438、443、448、452、455和458为vs-fcv特征性氨基酸位点(图6)。结果表明5株分离株与vs-fcv有6个位点吻合，7株分离株有5个位点吻合，1株分离株有4个位点吻合(表3)。

表3 fcv vp1蛋白部分e区强毒株特征性氨基酸位点分析table 3 vs-fcv characteristic amino acid sites analysis of partical e region in vp1 protein

图6 vp1蛋白部分e区的氨基酸比较图fig.6 comparison of amino acid sequences of partical e region in vp1 protein

2.7.1 病毒液tcid的测定 测定fcv-sh202101株和fcv-sh202113株细胞半数感染量分别为10和10tcid·ml。

2.7.2 感染猫的临床症状 fcv202101株和fcv2021131株感染中华田园猫后，48 h内幼猫陆续出现杯状病毒上呼吸道症状，如眼屎增多、气喘、咳嗽等，体温最高升至39.5 ℃，5 d后幼猫均濒临死亡。a组成年猫1周后出现眼屎增多现象，11 d后猫濒临死亡；b组成年猫1周后无明显的临床症状，2周后出现临床症状，精神沉郁、不食、发烧、眼屎大量增多，18 d后死亡。

2.7.3 感染猫的排毒情况 每日采集不同感染组猫的眼、鼻、口拭子，利用rt-pcr方法检测其排毒情况(表4)，结果表明，fcv202101株和fcv2021131株感染猫3 d后，可持续从眼、鼻、口拭子中检测到fcv。

表4 猫感染fcv后排毒情况table 4 virus shedding of cats after fcv infection

2.7.4 感染猫的发病与死亡情况 fcv202015株和fcv202031株感染猫后，均可导致试验猫的发病和死亡(图7)，对幼猫具有较强的致死性，且病程短、发病急，对成年猫也具有致死性，但病程长短不一。

图7 试验组猫感染fcv后存活率fig.7 survival rate of cats after fcv infection

近年来，随着国民生活水平的逐步提高，上海市猫宠呈逐年上升趋势，已逐渐成为宠物市场的主流。在猫的传染病病例中，猫杯状病毒感染病例占1/3以上。本研究对17例呼吸道症状的猫病例进行猫杯状病毒的分离，经过细胞病变、1测序、病毒电镜观察，13株分离株都鉴定为fcv，阳性率达到76.47%，与周孟云等在杭州宠物猫中调查的结果基本一致，表明上海市具有呼吸道症状的宠物猫杯状病毒感染比较普遍。

由于fcv的rna聚合酶缺乏校正功能，导致其基因组频繁变异，当出现vs-fcv时，就可能导致疫苗失去保护力。美国的pedersen等首次报道在1998年采集的样品中发现了vs-fcv，2003年英国及2009年法国也暴发过疫苗免疫的成年猫感染vs-fcv，2013年velasco等报道了西班牙暴发vs-fcv，2018年郭慧敏等首次报道了vs-fcv在我国流行。上海地区13株fcv分离株之间的1核苷酸序列相似性为74.3%～99.8%，与国内外参考株的核苷酸序列相似性为73.2%～80.1%，氨基酸相似性82.7%～91.9%，其中与疫苗株的核苷酸相似性只有73.2%～79.8%，氨基酸的相似性为82.7%～89.4%，分离株1核苷酸序列和氨基酸序列相似性均不高，符合fcv易突变的特征。遗传演化树显示，2株分离株与强毒株处于同一分支，8株分离株与国内经典株处于同一分支，3株分离株与国外经典株亲缘关系较近，研究表明，上海市主要流行株可能来自国内北方地区，少数毒株来自国外，与刘春国等研究结果一致，表明上海市fcv起源于不同祖先，其遗传存在生物多样性。虽然smith等认为fcv-f9疫苗株仍然能够预防fcv的感染，但是遗传演化树显示，本市分离株与疫苗株遗传关系较远，可能是当前疫苗对猫的免疫效果不佳的主要原因。

分离株与国内强毒株sh2014(shanghai)株相似性为74.7%～77.4%，与国外强毒株相似性为73.8%～82.9%。分离株与强毒株同源性虽然不一致，但是仅从核苷酸和氨基酸序列同源性上并不能将经典fcv与vs-fcv株区分出来。遗传演化树显示，fcv-sh202108株和fcv-sh202113株与强毒株遗传关系较近，其中，fcv-sh202113株与fcv-5处于同一分支，fcv-sh202108株虽然与经典株ls015处于同一分支，但同时与强毒株fcv-george walder、fcv-jengo、fcv-kaos、utcvm-h1、sh2014(shanghai)、utcvm-h2遗传关系较近，表明fcv-sh202108和fcv-sh202113株具有强毒株的可能。fcv1衣壳蛋白可分为a、b、c、d、e和f等6个区，其中e为超变区，有研究发现vs-fcv具有特征性氨基酸位点，foley等对e区具有vs-fcv突变特征的氨基酸位点进行比较分析发现，430位、438位、443位、448位、452位、455位和458位aa可能与其致病性相关。对e区中7个可能的强毒株特征性氨基酸位点分析，发现fcv-sh202101、fcv-sh202102、fcv-sh202107、fcv-sh202109和fcv-sh202110株有6个氨基酸位点与已公开vs-fcv株吻合，而已报道的广西株只有一个吻合位点。因此fcv-sh202101、fcv-sh202102、fcv-sh202107、fcv-sh202109和fcv-sh202110株也具有强毒株的可能。

从采样宿主临床症状、1进化树和vs-fcv特征性氨基酸位点进行分析，选择fcv-sh202101株和fcv-sh202113株进行动物感染试验，研究表明，fcv-sh202101株和fcv-sh202113株感染中华田园猫后均可导致发病和死亡，病毒的潜伏期为1～2 d，接种后第3天即可检测出排毒，不同年龄段猫的病程不一致，幼猫5 d后可导致死亡，成年猫病程可持续11～18 d，说明fcv-sh202101株和fcv-sh202113株可能为vs-fcv中国分离株，但vs-fcv的确诊还需要进一步研究病毒复制病例各脏器fcv的分布和滴度、病理变化以及可否造成感染猫的群体性发病与死亡等。

本研究从临床呼吸道症状猫分离到13株能在f81上形成cpe的病毒，经测序和电镜观察鉴定为fcv，1序列分析表明上海地区fcv流行株主要来自国内北方地区，少数毒株来自国外地区，动物感染试验表明2株fcv具有vs-fcv致病性特征，为vs-fcv毒株的筛选提供了有力的证据，也为fcv疫苗的研究提供了技术支持。