王 鹏，韩海银，李文韬，刘子嶷，储明星，刘玉芳*

(1.河北工程大学生命科学与食品工程学院，邯郸 056021；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 农业农村部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193)

低产羔数是制约肉羊产业发展的重要原因之一，影响产羔数的决定因素是排卵数和卵泡发育。颗粒细胞作为雌性动物卵巢组织的主要功能细胞，在卵泡发育过程中起重要作用。颗粒细胞增殖可以促进卵泡发育，凋亡则引发卵泡闭锁。从原始卵泡的激活开始，直至生长发育成熟为优势卵泡或闭锁的过程中，颗粒细胞通过分泌类固醇激素和生长因子支持卵母细胞的生长发育。颗粒细胞的生长发育对这一过程的影响尤为重要。因此，颗粒细胞增殖影响卵泡发育和闭锁的生物学机制一直备受研究人员的关注。近年来，wnt/β-catenin信号通路在颗粒细胞发育过程中的转录调控作用成为人们研究的热点。无翅型mmtv整合位点家族(wnt family member，wnt蛋白家族)是高度保守的信号分子，在真核生物中均有存在，通过编码分泌的脂蛋白和糖蛋白在wnt/β-catenin传导途径中起重要作用，其广泛参与哺乳动物原始卵泡的形成、卵泡成熟与闭锁过程。无翅型mmtv整合位点家族成员4(wnt family member 4，wnt4)是研究最广泛的wnt家族原型配体之一，可通过分泌细胞外信号因子在各种器官和细胞的发育中起关键作用。在小鼠中，4参与卵巢发育，雌性小鼠4表达缺失导致xx性腺的雄性化，而雄性过表达4则破坏睾丸血管和睾丸丙酮的合成，4过表达可以促进睾丸系统和睾酮合成。在人体中，4调控女性卵巢发育并阻止睾丸的形成，影响性别分化。4在颗粒细胞中高度表达，并通过wnt/β-catenin传导途径参与卵巢发育、颗粒细胞生长和卵母细胞成熟的过程。此外，4 还通过wnt/β-catenin传导途径参与了肾、肾上腺、乳腺和生殖系统的形成，从而影响哺乳动物的器官生长和细胞分化等。卵巢排卵是一个多步骤的过程，排卵数作为影响山羊产羔数的重要指标之一，受多种因素调控影响。颗粒细胞是卵泡发育的主要组成部分，也是卵母细胞提供营养物质和促进卵母细胞成熟的重要影响因素。本课题组在前期的云上黑山羊高、低产羔数卵巢组织转录组测序中发现，4存在两个可变剪接体4-α和4-β，4-α作为调节哺乳动物卵巢组织和控制颗粒细胞生理作用的关键生长因子，在卵巢排卵的过程中发挥作用，但可变剪接体4-β对山羊颗粒细胞的影响还未见报道，推测4-β可变剪接体可能通过影响颗粒细胞增殖，进而影响山羊排卵。

本研究以山羊颗粒细胞为试验材料，验证过表达或干扰4-β后wnt信号通路中关键标记因子及颗粒细胞增殖标记基因的表达，并通过鉴定颗粒细胞增殖速率、类固醇激素分泌进一步验证4-β可变剪接体在山羊颗粒细胞中的功能及调控机制。

从河北省廊坊市周边屠宰场获得山羊新鲜卵巢组织，置于37 ℃生理盐水(含2%双抗)运回实验室。75%酒精润洗消毒后，预热生理盐水(含1%双抗)清洗3次。10 ml注射器抽取直径2～6 mm卵泡的卵泡液，1 800 r·min离心5 min去上清，加入含有10% 胎牛血清的dmem-f12完全培养基重悬后1 500 r·min离心5 min去上清，重复2次。接种在5 cm培养皿中于co培养箱培养(37 ℃、5% co、饱和湿度)。颗粒细胞密度达70%后转入10 cm培养皿相同条件培养。

细胞rna提取试剂盒和反转录试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；dmem 基础培养基、dmem-f12培养基、含edta 的胰酶、pbs 缓冲液、胎牛血清(fbs)、青霉素和链霉素、lipofectamine2000 转染试剂盒、opti-mem试剂购自gibco；prime rtreagent kit 试剂购自takara；多聚赖氨酸、无水乙醇、氯仿、异丙醇等购自国药集团；trizol、山羊血清、4%多聚甲醛、全蛋白提取试剂盒、蛋白浓度测定试剂盒(bca)购自北京索莱宝科技有限公司(中国)；sybr green qpcr mix 购自thermo；细胞计数检测试剂盒(cck8)购自江苏凯基生物技术股份有限公司；荧光igg购自长春赛信生物公司；山羊雌二醇(e)检测和山羊孕酮(p)检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；sds-page电泳液、western转膜液、western 洗涤液、quickblockwestern封闭液、10%的sds-page凝胶、quickblockwestern抗体稀释液、pvdf 膜和超敏ecl化学发光试剂盒购自北京碧云天生物技术公司；wnt4-β抗体购自santa；β-catenin抗体购自abmart；gapdh、cyclin-d2、cdk4 和igg抗体均购自proteintech；其他均为常规化学试剂。

山羊卵泡颗粒细胞以1×10个·孔的密度接种于6孔板，每组3个重复。多聚赖氨酸处理爬片，置入6孔板中，36 h后取出。4%多聚甲醛固定20 min，pbs洗涤3次，每次3 min， 10%山羊血清孵育30 min，适量wnt4-β抗体4 ℃孵育过夜，pbs洗涤3次，每次5 min，适量荧光igg，37 ℃孵育1 h，pbs洗涤3次，每次5 min。dapi避光加入染细胞核5 min，pbs洗涤4次，每次5 min。荧光淬灭剂处理，树脂胶密封载玻片，荧光倒置显微镜(olympus)(莱卡，德国)观察采集图像。

根据ncbi数据库提供的山羊4-β cds区序列，设计相关引物以扩增cds区序列的基因片段，使用载体为pires2-egfp，同时合成pires2-egfp-4-β、pires2-egfp-4-β nc；si-4-β、si-4-β nc由rnai软件设计。载体均由上海生工生物科技有限公司(中国)合成。

转染前将山羊卵泡颗粒细胞以1×10个·孔的密度接种于6孔板(每组3个重复)，每孔2 ml dmem完全培养基，在37 ℃、5%的co饱和湿度条件下培养。取230 μl opti-mem与浓度为200 nmol·l的pires2-egfp-4-β(过表达组)、pires2-egfp-4-β nc(过表达对照组)、si-4-β(干扰组)、si-4-β nc(干扰对照组)各20 μl低速旋涡混匀。加入244 μl opti-mem和6 μl lipofectamine2000组成脂质体，形成转染复合体。室温孵育20 min；转染至颗粒细胞，每孔加入1.5 ml opti-mem，置于37 ℃，5% co饱和湿度条件下培养，6 h后更换为完全培养基培养，48 h后收集细胞与上清。

收集转染48 h后的颗粒细胞，根据组织/细胞rna提取试剂盒说明书提取总rna，根据反转录试剂盒说明书进行反转录。以cdna为模板进行rt-qpcr。rt-qpcr在20 μl的体积中进行，包含0.8 μl浓度为10 μmol·μl的引物，10 μl sybr green qpcr，2.0 μl 50 ng·μl的cdna，其余部分为ddho。反应条件：95 ℃预变性5 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共计40个循环。山羊19被用作参考基因进行校正。结果采用相对模板量算法(2-ΔΔ法)处理，基因相对表达量用2-ΔΔ表示。rt-qpcr引物的序列见表1，所用引物均由上海生工生物科技有限公司合成。

表1 rt-qpcr的引物信息table 1 primer information for rt-qpcr

使用全蛋白提取试剂盒提取细胞的总蛋白，收集转染pires2-egfp-4-β(过表达组)、pires2-egfp-4-β nc(过表达对照组)、si-4-β(干扰组)、si-4-β nc(干扰对照组)的颗粒细胞，在4 ℃条件下1 500 r·min离心5 min，弃上清，加入含有蛋白酶抑制剂的裂解液，匀浆后裂解30 min，每15 min震荡1次，在4 ℃条件下12 000 r·min离心30 min，收集上清。根据蛋白浓度测定试剂盒(bca)说明书测定bca曲线。按照1∶4加入5×sds loading buffer，混匀后金属水浴锅100 ℃煮10 min，蛋白分装后保存于-80 ℃。

蛋白质变性后，取30 μg蛋白上样于10%的sds-page凝胶上，电泳，80 v 15 min，120 v 60 min。电泳结束后将10%的凝胶转移至pvdf膜上，150 ma 60 min，抗体(wnt4-β、gapdh、cyclin-d2和cdk4均按1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜。tbst洗涤5次，每次5 min。二抗(1∶1 000)室 温孵育1 h，特超敏ecl化学发光试剂显色，odyssey clx成像系统(li-cor)曝光，拍照并保存。使用image j软件分析条带灰度值，目的蛋白与gapdh灰度值的比值即为目的蛋白的相对表达水平。

以每孔2×10/100 μl的密度将转染pires2-egfp-4-β(过表达组)、pires2-egfp-4-β nc(过表达对照组)、si-4-β(干扰组)、si-4-β nc(干扰对照组)的颗粒细胞接种到96孔板中，每组3个重复，在37 ℃、5% co饱和湿度条件下预培养24 h。根据细胞计数试剂盒(cck-8)说明书，分别在细胞生长0、6、12、24、48和72 h时每孔加入10 μl cck-8溶液，培养箱孵育1 h，用酶标仪测量450 nm的吸光度，观察颗粒细胞增殖情况。

按照雌二醇(e)和孕酮(p)elisa试剂盒说明书对转染颗粒细胞后的细胞培养液中雌二醇(e)和孕酮(p)浓度进行检测。根据制造商协议，在酶标板上设置标准孔和空白孔各3个。加入40 μl转染pires2-egfp-4-β(过表达组)、pires2-egfp-4-β nc(过表达对照组)、si-4-β(干扰组)、si-4-β nc(干扰对照组)后的细胞上清液，每组3个重复。然后加入10 μl的待测样品。弃去液体，摇干，用洗涤液注入每个孔，静置30 s后弃去，重复5次，拍干。除空白孔外，每孔加入50 μl的酶标试剂。用密封膜密封平板，37 ℃ 孵育30 min。弃去液体，摇干，向每孔注入洗涤液，静置30 s后弃去，重复5次，拍干。在每孔中加入50 μl显色剂a和50 μl显色剂b，轻轻摇动混合，37 ℃避光显影15 min。向每个孔中加入50 μl终止液以终止反应。在450 nm处依次测量各孔的吸光度(od值)。

每个试验3个生物学重复，使用spss 18.0 (spss inc. chicago，il，usa) 软件进行统计分析，数据均用“平均值±标准差”表示。**