段晨莹，李 欣，赵羚均，许师源，原开敏，董智豪,3，郭冠华,4，王 栋*

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；3.河南科技大学动物科技学院，洛阳 471203； 4.山西农业大学动物科学学院，太谷 030801)

睾丸和附睾是哺乳动物精子发生和成熟的主要场所，精子发生需经过精原干细胞增殖、减数分裂和精子变形等过程，变形后的精子离开睾丸进入附睾后，进一步发育成熟并逐渐获得运动能力。该过程正常、高效、有序运行，是确保精子功能正常的必要条件，需要精细而复杂的表达调控，期间的基因表达也就成为精子发生机制研究的重要内容，为此，很多研究通过精子基因组、转录组和蛋白质组挖掘雄性生育力的分子靶标。据统计，1头种公牛一次射精可产生数十亿精子，但精子功能基因组缺陷导致种公牛生精功能紊乱，生育能力变差，增加不孕风险，降低生产效率。为深入探究精子发生机制，深度挖掘种公畜的繁殖潜能，本团队前期对牛和小鼠精子变形期间差异基因进行富集分析和蛋白网络互作分析，发现了差异表达基因adp-核糖基转移酶3(adp-ribosyl transferase 3，3)，该基因对精子变形发挥了重要的调控作用。

art3是单-adp-核糖基转移酶(mono(adp-ribosyl) transferases，arts)家族成员，该家族以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，nad)为底物，将adp-核糖基团转移至目标蛋白的氨基酸残基上，完成对目标蛋白的adp-核糖基化修饰。研究发现，参与adp-核糖基作用的主要氨基酸残基为精氨酸和半胱氨酸，然而，friedrich等通过art3蛋白结构分析和体外转染art3酶活试验，发现art3不具有arts家族特有的精氨酸特异性酶活性，也不具有半胱氨酸特异性酶活性，推测体外条件下art3可能完全丧失了adp-核糖基转移酶活性，但是，该研究没有深入挖掘该基因的生物学功能。研究发现，在人和牛精母细胞上可检测到art3蛋白，也可在小鼠和牛精子变形期间检测到其表达，并且检测到3基因与人非阻塞性无精症(non-obstructive azoospermia，noa)显著相关，是导致男性不育的重要因素。但是，目前尚未见到关于3基因参与调控精子发生机制的报道，也未见到该基因缺陷导致noa和男性不育机制的报道，art3的确切生物学功能还需深入研究。

为此，本试验以小鼠为模式动物，通过睾丸注射不同剂量art3抑制剂3-甲氧基苯甲酰胺(3-methoxybenzamide，3-mba)，检测小鼠睾丸生理指标，分析附睾尾精子的动力学和形态学特征，探究art3调控小鼠精子发生机制，为提高雄性动物繁殖性能提供理论依据，也为治疗雄性不育提供可治疗的分子靶点。

试验动物为6～8周龄健康且繁殖性能正常的雄性icr小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。整个试验过程中，试验动物在20～25 ℃、自然光照条件下饲养，自由采食、饮水，每周更换1次垫料。试验鼠及试验方法均符合中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物实验福利伦理审查(no：ias2019-13)要求。

3-mba、二甲基亚砜(dmso)购自美国sigma公司；戊巴比妥钠购自德国merck公司；无水乙醇、75%医用酒精和二甲苯购自北京化学试剂公司；石蜡购自上海华灵康复器械厂；多聚甲醛购自天津市光复精细化工研究所；生理盐水购自北京萃锋科技有限公司；苏木素、苏木素分化液、苏木素返蓝液、伊红购自武汉赛维尔生物有限公司。

3-mba溶液配制：参考shi和lodhi等的方法，用dmso将3-mba粉末配置为浓度为0.302、0.906和1.510 mg·ml的溶液，配置方法如下：电子天平称取0.302、0.906和1.510 mg的3-mba粉末，分别溶解在1 ml dmso中。

随机选取66只雄性小鼠，其中63只分为3组，每组21只，分别注射浓度为0.302、0.906和1.510 mg·ml的3-mba，其余3只为对照组，注射dmso溶液。在注射3-mba前，以60 mg·kg体重剂量腹腔注射2%戊巴比妥钠，待小鼠完全处于麻醉状态后使其保持仰卧姿势，将睾丸从腹腔轻轻揉入阴囊后，用75%医用酒精对阴囊部位消毒，左手食指与拇指固定单侧睾丸，右手持连接1 ml注射器的无菌静脉输液针(内含3-mba注射液)，根据睾丸表面血管分布情况，避开睾丸白膜上的血管直接穿透阴囊进入睾丸，用力推注射器将3-mba注射液缓慢注入睾丸，根据小鼠体重决定注射剂量，计算方法为3-mba注射液体积等于小鼠体重(v=m，v为注射体积，单位μl；m为小鼠体重，单位g)。对侧睾丸同样处理后，处理鼠单笼饲养。对照组雄性icr小鼠双侧睾丸分别注射与处理组等体积的dmso溶液。

于注射3-mba溶液3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d后，脱颈处死试验鼠，用剪刀打开小鼠腹腔，从阴囊中取出小鼠双侧睾丸和附睾，将睾丸置于含4%多聚甲醛溶液的1.5 ml离心管中固定24～48 h；附睾置于含1 ml生理盐水的1.5 ml离心管中，并用眼科剪剪碎附睾尾组织。然后，将离心管置于37 ℃水浴锅恒温保存20 min，以使精子从附睾尾充分浮游至上清液。

1.5.1 制作睾丸组织石蜡切片 将固定好的小鼠睾丸组织依次置于50%乙醇(1.5 h)、75%乙醇(1.5 h)、85%乙醇(1 h)、95%乙醇(1 h)、无水乙醇Ⅰ(30 min)、无水乙醇Ⅱ(30 min)的梯度酒精中脱水，然后依次采用二甲苯∶无水乙醇=1∶1的混合液(1 h)、二甲苯Ⅰ(1 h)、二甲苯Ⅱ(1 h)透明后，于溶解好的石蜡中浸泡3 h。包埋好后，经石蜡切片机切割成5 μm厚睾丸切片，将切片置于40 ℃左右温水中展片，再用黏附载玻片贴片后置于55 ℃恒温干燥箱中烤片5 h，使组织切片完全贴合在载玻片上。

1.5.2 he染色 石蜡切片经二甲苯Ⅰ(30 min)、二甲苯Ⅱ(30 min)脱蜡后，依次置于二甲苯∶无水乙醇=1∶1的混合液、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、50%乙醇中各复水5 min，再用蒸馏水洗5 min；然后用苏木素染色3 min、蒸馏水洗3 min、分化液分化10 s、蒸馏水洗2 min、返蓝液返蓝20 s、蒸馏水洗2 min、伊红染色8 min、蒸馏水洗5 min，睾丸石蜡切片经h&e染色后，依次经85%乙醇(1 min)、95%乙醇(1 min)、无水乙醇Ⅰ(5 min)、无水乙醇Ⅱ(5 min)的梯度酒精脱水，再经二甲苯Ⅰ(5 min)、二甲苯Ⅱ(5 min)透明；最后，用中性树脂封片，置于正置荧光显微镜下观察。

1.6.1 附睾尾精子的精液质量分析 用移液枪从附睾上清液中吸取10份精子悬液(每份5～10 μl)分别滴至37 ℃预热的leja板中，静置2 min，用hamiltonthorne ivos ii全自动精子分析仪分别在200×和400×镜下进行镜检。镜检时，随机选取leja板中的8个不同区域进行分析。镜检后统计每份精液的浓度、前向运动精子百分率和活力，并计算出均值。

1.6.2 精子畸形率分析 用移液枪从附睾上清液中吸取10 μl精子悬液滴至黏附载玻片上，并用枪头涂抹均匀，涂片后用酒精擦拭过的盖玻片封片，并在室温下风干。然后，将制作好的切片置于100×油镜下检查精子形态，计数结构完整和畸形的精子，畸形精子主要类别有：胖头精子、圆头精子、双头精子、无头精子和尾部角弯折、卷曲、断裂、双尾精子等。每只小鼠检查1 000个精子，畸形率(%)=((1 000-正常精子)/1 000)×100。

使用excel和spss 20.0软件进行数据整理和统计分析，采用单因素anova法进行方差分析，采用检验进行组间差异显著性检验，