刘欣杰，吴晓雪，刘素平，袁利明，陈 宁，赛务加甫

(石河子大学动物科技学院，石河子 832003)

卵母细胞体外成熟是一种辅助生殖技术，对改善动物生殖发育、生殖健康和繁殖至关重要。通过模拟机体内环境，使得卵母细胞可以在机体外进行培养，其成熟过程主要包括细胞的减数分裂及卵母细胞的核、质、膜、透明带和卵丘细胞的成熟。众所周知，卵母细胞的成熟是一个复杂的生理过程，在体外成熟培养的过程中许多卵母细胞都发生退化，只有部分卵母细胞可发育成熟。在卵母细胞成熟过程中，每一步都需要相关基因的及时和适当表达，以及不同水平的相关影响因素的精确调节，以确保卵母细胞的正常成熟。在这个过程中，特定分子在不同阶段的表达、激素、ph的变化以及卵母细胞结构的变化都十分重要。

磷脂酰肌醇特异的磷脂酶c(phospholipase c，plc)可使磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(pip2)水解为第二信使肌醇-1，4，5-三磷酸(pip3)和二酰甘油(dag)，在调节各种受体分子的细胞内信号转导中起着关键作用。pip3可使内质网钙库释放出ca，使细胞内ca的浓度升高；dag可激活蛋白激酶c(protein kinase c，pkc)，继而引发下一步的信号传递。迄今为止，已有6种已知的plc同种类型，β、γ、δ、ε、ζ和η，其中plc-γ可作为一种传递信号参与受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，rtk)介导的细胞分裂、抗原抗体结合引起免疫反应及卵细胞受精等过程。磷脂酶c-γ1(phospholipase c-γ1,plc-γ1)作为plc家族的成员，除参与细胞分裂外，其在细胞迁移、运动和分化中也有重要作用。通常过度表达rtk下游分子会引起肿瘤转移，plc-γ1也具有这种作用；一般认为，rtk的下游分子能刺激或抑制细胞分化，也有报道证明plc-γ1能诱导培养神经细胞生长与分化。dittmar等报道，表皮生长因子(epidermal growth factor, egf)诱导乳腺癌细胞的迁移是由plc-γ1的短暂激活引起的。smith等报道，在小鼠3yi的纤维原细胞中plc-γ1的过表达会导致细胞发生恶性转化。plc-γ1蛋白在不同家畜、物种及进化过程中具有较高的序列保守性，对于细胞的生长、增殖、胚胎发育等都有着重要影响。

卵母细胞凋亡是影响卵巢生殖细胞衰竭的主要原因之一，是其质量和发育能力的代表，对各种哺乳动物的生育能力都有着直接影响。在细胞凋亡过程中，线粒体激活并释放caspase，随着黄体细胞年龄的增长，caspase-3和bax在黄体细胞中的比例增加。6是一种抗卵巢癌有效的基因，参与了卵母细胞减数分裂途径。plc抑制剂u73122可以抑制小鼠胚胎干细胞的增殖，而pkc可以抑制细胞凋亡。然而，目前关于plc-γ1对绵羊卵母细胞体外培养影响的研究较少。考虑到卵母细胞凋亡在卵母细胞发育中的基本作用，本试验研究了plc-γ1是否对绵羊卵母细胞的成熟具有调控作用。

1.1.1 主要试剂 tcm199、dmem购自美国lifetechnology公司；prime rt reagent kit with gdna eraser (perfect real time)试剂盒购自takara有限公司；生理盐水、抗生素均购自石河子药店；胎牛血清(fbs)购自gibco公司；脱脂奶粉购自美国bd公司；u73122、m-3m3fbs购买于上海absin生物科技有限公司；聚偏二氟乙烯膜、预染蛋白marker购自赛默飞世尔科技公司；全蛋白提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；plc-γ1一抗、bak一抗、bax一抗、casp3一抗、casp8一抗、p53一抗、bcl6一抗、β-actin一抗、羊抗兔辣根过氧化物酶标二抗均购自abcam公司；genelute单细胞rna纯化试剂盒、绵羊用割卵液、成熟培养液、sofaa胚胎培养液配方所用试剂均购自sigma公司。

割卵液：pbs 95 ml、heperin 0.005 g、penicillin 0.008 g、streptomycin 0.005 5 g、phenol red 0.001 g、fbs 5 ml。成熟培养液：tcm199 0.92 g、nahco0.25 g、hepes 0.246 3 g、na-py 0.033 g、glutamine 0.005 g、0.075 iu·mlhmg 1 ml、1 μg·ml17β-雌二醇 1 ml、s/n 0.007 g、phenol red 0.001 g、fbs 10 ml、无菌去离子水88 ml。sofaa胚胎培养液：nacl 0.632 5 g、kcl 0.048 2 g、khpo0.012 3 g、nahco0.265 1 g、na-py 0.003 6 g、l-glutamine 0.015 8 g、bsa 0.8 g、cacl·2ho 0.024 8 g、mgcl·6ho 0.01 g、bme(amino acids) 2 ml、mem(amino acids) 1 ml、sodium lactate 28.22 μl、pencillin 0.008 g、strep 0.005 5 g、phenol red 0.001 g、无菌去离子水96.97 ml。

1.1.2 主要仪器和设备 微量移液器(eppendorf公司)；超净工作台(zhjh-1112)；恒温水浴锅(dkb-510a)；超速离心机(eppendorf，centrifuge-5415d)；立式高压灭菌锅(zeal-gr60da)；离心机(thermo)；聚丙烯凝胶电泳仪(dyy-8b)；显微镜加热板(cryologic)；倒置荧光显微注射操作仪(nikon)；formasteri-cultco2 incubators(thermo)；实时荧光定量pcr仪(瑞士罗氏公司)；protein simple成像仪(美国protein simple公司)。

1.1.3 引物设计 根据genbank中的基因序列，利用primer premier 5.0软件设计实时定量pcr引物序列(表1)。引物序列由生工(上海)生物技术有限责任公司合成。

表1 引物序列table 1 primer sequences

1.2.1 绵羊卵母细胞的收集 绵羊卵巢采自新疆石河子市屠宰场，保温在添加青链霉素(100 iu·ml)的38.5 ℃生理盐水中，2 h内运回实验室。用加入抗生素的生理盐水(37 ℃预热)冲洗绵羊卵巢 2～3次，剔除周围的结缔组织后继续用加入抗生素的生理盐水洗涤2次，将预热平衡2 h的割卵液取出，将卵巢放入含2 ml割卵液的60 mm培养皿中并用镊子固定，肉眼可见卵巢表面卵泡则用11 cm手术刀片切开，然后用捡卵针收集割卵液中胞质均匀、包裹卵丘细胞3层及以上的卵丘-卵母细胞复合体(cocs)。

1.2.2 plc抑制剂u73122及激活剂m-3m3fbs的稀释 在电子天平上称取5 mg的u73122及m-3m3fbs溶解于1 ml的dmso中，配置成5 mg·ml的u73122及m-3m3fbs溶解液，按试验需要添加到成熟培养液中，直至获得所需的浓度。通过反复吹打混合充分。在玻片上滴加一滴配置好的稀释液，显微镜下观察是否有沉淀。

1.2.3 绵羊卵母细胞在不同条件下的成熟培养 将收集到的cocs在成熟培养液中润洗3次后随机转移至含有不同浓度的u73122(0、0.005、0.05、0.5、5、50 μmol·l)及m-3m3fbs(0、0.005、0.05、0.5、5、50 μmol·l)的成熟培养液中进行成熟培养，培养条件为38.5 ℃、5% co饱和湿度。每个浓度150个细胞，重复试验3次。

1.2.4 绵羊卵母细胞在不同培养条件下的成熟状态统计 将cocs体外成熟培养22 h后，在透明质酸酶中作用5 min除去颗粒细胞，然后在体视显微镜下观察统计成熟卵母细胞排出第一极体的概率。

1.2.5 孤雌激活和早期胚胎的培养 收集经0.5 μmol·lu73122及0.5 μmol·lm-3m3fbs处理后成熟的卵母细胞150个，用离子霉素联合6-dmap进行孤雌激活，即离子霉素作用5 min后放入6-dmap中作用4 h后，将细胞放入sofaa液中，在培养条件为5% co、38.5 ℃饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，重复试验3次。

1.2.6 绵羊早期胚胎发育状况统计 培养24 h后观察卵母细胞卵裂情况，48 h开始统计卵母细胞卵裂率，168 h统计卵母细胞桑葚胚率。

1.2.7 实时定量pcr检测绵羊卵母细胞中-1 mrna表达情况 使用genelute单细胞rna纯化试剂盒对0.5 μmol·lu73122及0.5 μmol·lm-3m3fbs培养48 h后的绵羊卵母细胞进行总rna提取，进行反转录试验，对反转录后的产物进行qpcr反应，反应结束后，计算mrna水平上-1表达情况。

1.2.8 western blot检测绵羊卵母细胞中plc-γ1蛋白表达情况 使用全蛋白提取试剂盒对0.5 μmol·lu73122及0.5 μmol·lm-3m3fbs培养48 h后的绵羊卵母细胞进行总蛋白提取，5×sds蛋白上样液煮沸变性，免疫印迹法检测plc-γ1蛋白表达。

1.2.9 实时定量pcr检测绵羊卵母细胞中、、3、8、53、6 mrna表达情况 使用genelute单细胞rna纯化试剂盒对0.5 μmol·lu73122及0.5 μmol·lm-3m3fbs培养48 h后的绵羊卵母细胞进行总rna提取，进行反转录试验，对反转录后的产物进行qpcr反应，反应结束后，计算mrna水平上、、3、8、53、6表达情况。

1.2.10 western blot检测绵羊卵母细胞中bak、bax、casp3、casp8、p53、bcl6蛋白表达情况 使用全蛋白提取试剂盒对0.5 μmol·lu73122及0.5 μmol·lm-3m3fbs培养48 h后的绵羊卵母细胞进行总蛋白提取，5×sds蛋白上样液煮沸变性，免疫印迹法检测bak、bax、casp3、casp8、p53、bcl6蛋白表达。

1.2.11 统计分析 使用graphpad prism 8.0绘制结果图。采用ibm spss statistics 26软件对数据进行分析。各组间的多重比较采用邓肯检验进行评估。单因素方差分析(anova)用于确定多组之间的差异。两组间差异采用检验。数据以“平均值±sem”表示。