夏博策，张凯艺，苗佳坤，杨 宇，彭焕祺，王彦芳，杨述林

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 动物营养学国家重点实验室，北京 100193)

羧肽酶b2(carboxypeptidase b2，2)，是凝血酶激活的纤溶抑制物(thrombin activatable fibrinolysis inhibitor，tafi)的编码基因，故2基因又称之为基因。tafi前体酶原主要在肝中合成，含有423个氨基酸，在去除22个残基的信号肽后，以56 ku分子量的酶原(tafi)分泌到血液循环中。tafi包含92个残基的(n末端)活化肽(phe1-arg92)和309个残基的催化结构域(ala93-val401)。tafi具有较低的羧肽酶酶原活性，其真正发挥羧肽酶活性需要利用胰蛋白酶样蛋白酶对arg92-ala93肽键切割去除激活肽后形成活化的tafi(activated tafi，tafia)。tafia是一种锌依赖性外肽酶，可切割羧基末端(赖氨酸)肽键。目前，已经在蛋白质数据库(pdb)中在线发表了17个包含人、牛和猪的tafi或tafia的结构。

tafia主要被认为具有抗纤溶的作用，可参与凝血与纤溶、伤口愈合等过程；除上述作用外，其还具有一定的抗炎症作用，能够灭活炎症蛋白如过敏毒素c3a和c5a等。tafi异常与心血管疾病和血栓性疾病有关，例如有研究中敲除鼠未表现出可观察的明显表型，但在fecl诱导腔静脉血栓研究中，敲除鼠中形成的血栓显著减少，显示tafi在血栓形成过程中存在重要作用。也有研究探讨了tafi编码基因2的多态性与2型糖尿病的关系。可见，tafi紊乱与疾病密切相关，可被用作潜在的治疗靶点。

目前，关于人和鼠的2基因报道较多，通过在ncbi数据库中检索2基因信息，显示人类2基因存在两种已验证转录本(nm_001278541.2和nm_001872.5)，一种预测转录本(xm_0170203932)，对转录本之间进行比较发现存在外显子跳跃和5′端可变剪接事件。目前，对于猪的2基因及可变剪接的研究较少。前期本实验室巴马小型猪肝转录组测序显示，猪2基因可能存在多种可变剪接体。本研究通过rt-pcr技术及基因平末端克隆技术扩增猪2基因的cds区及部分非编码区，利用生物信息学工具预测2编码蛋白的基本生物学特征，进一步通过rt-pcr技术检测2基因在肝、心、肾、皮下脂肪、肠系膜脂肪、股二头肌和背最长肌中的表达特征；以实验室制备的代谢性疾病易感猪(转3148、和基因猪)为试验动物，利用qrt-pcr技术检测在富营养饮食效应下的肝中2基因的表达特征。本研究结果将为2基因功能及转录调控提供理论参考。

本试验选用健康状态和体重相同的3头12月龄巴马小型猪，安乐死后收集肝、心、肾、皮下脂肪、肠系膜脂肪、股二头肌和背最长肌等组织样本；选用健康状态和体重相同的4头9月龄代谢性疾病易感猪(转3148、和基因猪)饲喂高脂高能量饲料(53%基础日粮、37%蔗糖和10%猪油)作为富营养饮食试验组(tg-hshfd)，4头9月龄代谢性疾病易感猪饲喂基础日粮作为对照组(tg-cd)，试验期3个月，安乐死后收集肝等组织样本；采集的所有组织样品全部置于液氮内备用；所有巴马小型猪试验均经中国农业科学院北京畜牧兽医研究所实验动物伦理委员会许可(许可证号：ias2019-12)，单栏饲养，日饲2次，自由饮水，温度16～28 ℃，相对湿度40%～70%。

trizol试剂(invitrogen，美国)；高保真酶2×phanta flash master mix(vazyme，中国)；50×tae(solarbio，中国)；琼脂糖(biowest，西班牙)；dna mark试剂(generay，中国)；琼脂糖凝胶dna试剂盒(tianmobio，中国)；5 min ta/blunt-zero cloning kit载体克隆试剂盒(vazyme，中国)；dh5ɑ感受态(vazyme，中国)；prime rt reagent kit with gdna eraser反转录试剂盒和tb greenpremix ex taq荧光定量试剂盒(takara，日本)等。

1.3.1 引物设计与合成 经ncbi数据库获取2序列(登录号：xm_001929146.4)及基因组序列，利用ncbi primer blast设计2-1、2-2及2-3的全长扩增引物(上游引物fq和下游引物rq)，根据基因克隆序列设计2-1、2-2及2-3定量引物(上游引物fd和下游引物rd)，内参基因为18s。引物序列(表1)由北京擎科生物公司合成。

表1 引物基本信息table 1 basic information of primers

1.3.2 组织总rna提取及cdna反转录 传统trizol法提取样品组织总rna，利用1%浓度琼脂糖凝胶和nano-100检测仪检测rna完整性和rna浓度；利用prime rt reagent kit with gdna eraser 试剂盒合成cdna(-20 ℃储存)。

1.3.3 rt-pcr试验及基因克隆 以巴马小型猪肝组织cdna作为模板，扩增2基因序列，rt-pcr反应总体系为50 μl：2×phanta mix 25 μl，cdna 2 μl，上游引物f 2 μl，下游引物r 2 μl，ddho补至50 μl。pcr反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，34个循环；72 ℃延伸5 min。反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪显影琼脂糖凝胶目的条带，编辑并保存图片。

利用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒对目的条带进行dna纯化回收。利用5 min ta/blunt-zero cloning kit 试剂盒克隆目的片段，反应总体系为5 μl：5×ta/blunt-zero cloning mix 1 μl，pcr纯化产物2 μl，ddho 2 μl。反应程序：37 ℃连接5 min。采用热应激法将连接产物转化至dh5α感受态细胞，用amp抗性的固体培养基37 ℃培养12 h，挑取单菌落转入amp抗性的液体培养基37 ℃培养2 h，菌液pcr检测阳性菌送至北京擎科生物公司双向测序。

1.3.4 qrt-pcr试验 利用tb greenpremix ex taq荧光定量试剂盒检测2基因表达量，qrt-pcr反应总体系为20 μl：sybr green 10 μl，ddho 6.8 μl，上游引物f 0.4 μl，下游引物r 0.4 μl，rox dye ii 0.4 μl，cdna 2.0 μl。qrt-pcr反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。每个样品重复2次，18s为内参基因，分析数据使用2法计算各目的基因的mrna相对表达量。

1.3.5 生物信息学分析 利用snapgene、dnaman 8软件比对基因序列和蛋白序列；利用swiss-pdbviewer软件编辑蛋白质三维结构；利用cytoscape 软件绘制相关性网络图；其他在线工具如表2。

表2 在线工具基本信息table 2 basic information of online tools

试验数据经过sas 9.1 软件和graphpad prism 8软件进行-test统计学分析，