代宇星，史银银，温作晨，罗云燕，祝雪丽，郑春婷，李淑英，洪 亮，张建斌，郭 亮，蒲 蕾

(天津农学院动物科学与动物医学学院 天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 300384)

全羧化酶合成酶(holocarboxylase synthetase, hlcs)是动物体内多种羧化酶的合成酶，通过催化生物素与体内无活性的羧化酶共价连接，使其形成有活性的羧化酶。hlcs调控的羧化酶主要有乙酰辅酶a羧化酶(acetyl-coa carboxylase, acc)、丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase, pc)、丙酰辅酶a羧化酶(propionyl-coa carboxylase, pcc)和甲基巴豆酰辅酶a羧化酶(3-methylcrotonyl-coenzyme a carboxylase, mcc)4种。通过hlcs合成产物酶之一acc可以催化乙酰辅酶a转化为丙二酸单酰辅酶a，阻止乙酰辅酶a进入三羧酸循环。细胞糖酵解的产物丙酮酸穿梭进入线粒体，可利用hlcs合成产物酶之一pc转化为草酰乙酸进入三羧酸循环产能，并且pc在糖异生过程中也至关重要。因此hlcs的产物酶与细胞糖酵解关系密切。缺失会导致生物素与羧化酶结合产生障碍，从而造成代谢产物在机体内蓄积，使糖代谢出现障碍。

综上表明，hlcs与细胞糖酵解有关，但hlcs对细胞糖酵解的影响鲜有报道。因此，本研究利用sirna片段干扰基因，通过检测在c2c12细胞成肌成脂分化过程中糖酵解相关基因的表达情况，探明基因对c2c12细胞成肌成脂分化后糖酵解的影响。

c2c12细胞由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所猪遗传育种创新团队提供；dmem培养液、胎牛血清、马血清、胰岛素购于gibco公司；生物素(维生素b7)、转膜液、电泳液和发光液购于索莱宝公司；bodipy493/503染料购于invitrogen公司；地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(ibmx)、油红o染料购于sigma公司；taq dna聚合酶、dntp混合物、反转录试剂盒和荧光定量染料均购于takara公司；hlcs、pkm和gapdh一抗、fitc标记山羊抗兔igg(h+l)购于碧云天生物技术有限公司；ripa裂解液购于上海雅酶生物医药科技有限公司；sirna片段合成于吉玛基因公司。

1.2.1 c2c12细胞的培养与sirna转染 将c2c12细胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的dmem高糖培养基，于37 ℃、5% co培养箱中培养。待细胞达到70%汇合时，用胰蛋白酶消化细胞3～5 min，加入等量培养基终止消化，以1∶3比例接种细胞。

将对数期生长的细胞以每孔2.4×10个细胞的密度铺入6孔板中，待24 h细胞贴壁后，更换为opti培养基后继续培养1～2 h，利用lipofectamine 3000转染试剂转染sirna。sirna处理8～12 h后，更换为生长培养基。

1.2.2 c2c12细胞诱导分化及生物素处理 成肌分化：c2c12细胞接触抑制后1 d，开始诱导分化。用含有2%孕马血清和100 u·ml青链霉素的dmem诱导液诱导成肌分化，2 d后更换为生长培养基。

成脂分化：c2c12细胞接触抑制后1 d，开始诱导分化。用孕马血清成肌诱导液诱导成肌分化2 d后，再用含有0.5 mg·l地塞米松、0.5 mmol·libmx、10 μg·ml胰岛素的dmem诱导液诱导成脂分化，最终分化为c2c12脂肪细胞。

生物素处理：前期研究发现1 μmol·l添加量为最适添加量。在诱导分化过程中，加入1 μmol·l浓度生物素处理细胞，共设4个处理组：1)对照组(nc)；2)生物素组(biotin)；3)干扰组(sihlcs)；4)生物素与干扰共同处理组(sihlcs+biotin)。

1.2.3 油红o染色和bodipy染色 成脂分化c2c12细胞用pbs清洗2～3次，用4%多聚甲醛固定细胞15 min后，再用pbs清洗3次。

油红o染色：油红o染液37 ℃孵育30 min。再用pbs清洗3次。利用倒置显微镜观察染色情况。

bodipy染色：bodipy染料避光孵育30 min，再用pbs清洗3次。加入dapi染料，染核5 min，pbs洗3次。利用倒置荧光显微镜观察拍照。

1.2.4 免疫荧光染色 c2c12细胞诱导成肌分化4 d后，弃去培养基，用pbs清洗3次。用4%多聚甲醛固定细胞30 min，pbs清洗3次。通透液通透细胞15 min，pbs清洗1次。封闭液封闭1 h，pbs清洗1次。用封闭液按100∶1的比例稀释一抗myog，4 ℃孵育过夜或37 ℃孵育2 h。fitc荧光二抗，37 ℃避光孵育1.5 h。dapi核染5 min，用pbs清洗3次，去除非特异染色，加入抗荧光淬灭剂。荧光显微镜下观察染色后的肌管形态，并拍照。

1.2.5 实时定量荧光pcr(rt-qpcr) 通过primer软件设计引物，引物序列见表1。以cdna为模板，进行rt-qpcr反应，pcr反应体系18 μl：2×qpcr mix 9 μl，模板3 μl，上、下游引物各1 μl，ddho 4 μl。pcr程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。以为内参基因，且基因的相对表达量用2方法计算。

表1 实时荧光定量pcr引物序列table 1 primer sequences for real-time quantitative pcr

1.2.6 蛋白质免疫印迹(western blotting) 将c2c12细胞诱导分化，提取分化6 d的细胞总蛋白。将变性处理后的蛋白在page凝胶上进行点样，80 v 30 min后转110 v 1.5 h，再将凝胶进行转膜2 h。在室温下用5%脱脂奶封闭硝酸纤维膜30 min，加入myog一抗4 ℃孵育过夜，次日tbst清洗3次，每次10 min，再加入fitc二抗孵育2 h，最后用tbst清洗3次，每次10 min。用辣根过氧化物酶对硝酸纤维膜进行曝光，获得蛋白条带，并利用imagej软件进行灰度分析。

利用spss统计数据并进行方差分析(one-way anova)。试验数据以“平均值±标准差”的形式表示。