朱 兰，王 鹏，欧阳依娜，江炎庭，兰 蓉*

（1.云南省畜牧兽医科学院，云南昆明 650224；2.云南省种羊繁育推广中心，云南寻甸 650000）

云上黑山羊是在低纬高原气候条件下，以努比山羊为父本、云岭黑山羊为母本，采用现代动物遗传育种技术，历经22 年5 个世代选育出的黑山羊新品种，具有体质结实、生长速度快、较高繁殖性能、肉质鲜美等特性，是深受我国南方地区人民喜爱的山羊品种。研究云上黑山羊的不同核心育种群的遗传多样性，对于正确评价和掌握云上黑山羊核心育种群的遗传结构和变化规律，使育种群保持科学的动态交流和调整、有效降低遗传相似性、优化品种遗传结构具有重要意义。

群体的遗传多样性分析对种质资源的遗传评价与利用、新品种（系）的培育具有重要意义，通过深层次挖掘并分析群体间亲缘关系远近程度，可以更为科学地指导生产。随着分子技术的发展，snp（single nucleotide polymorphisms）检测分析被越来越多的使用于山羊遗传多样性、群体结构分析、重要性状关联分析中，其中大多基于全基因组重测序和基因芯片技术开展，应用massarray snp 质谱阵列基因分析技术开展山羊群体遗传多样性的研究较少，在云上黑山羊研究中尚未有报道。massarray snp 质谱阵列基因分析技术通过pcr 扩增延伸跨越snp 位点的dna 序列，再使用飞行质谱（time of flight，tof）进行分析，根据碱基的分子量差别对snp 进行分型，实验设计灵活，分型结果准确率可达98%，尤其在分析大量snp 位点时极具价格优势，有较高的性价比。

snp 即单核苷酸多态性，主要指在基因组水平上的单个核苷酸的变异，是继rflp、rapd、aflp、ssr 等第1 代和第2 代分子标记技术之后发展起来的第3 代分子标记技术，具有较高的遗传稳定性、丰富的多态性、检测快速等特点，被广泛应用于关联分析、亲缘鉴定等动物分子遗传研究中。massarry 核酸质谱分型系统基于基质辅助激光解吸电离分型时间质谱技术（maldi-tof），是世界上领先的基因分型工具。该技术完美融合了pcr 技术的高灵敏性、芯片技术的高通量和质谱技术的高精确度，适用于前期经过重测序或关联分析等工作获得少量snp 位点的验证实验，分型结果准确性可达98%，检出率可达95%，具有极高的准确率和最佳性价比。

本研究选取25 个snp 位点，应用massarray 基质辅助激光解吸电离飞行时间（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight，maldi-tof）质谱基因分型法对云上黑山羊3 个核心群的遗传多样性进行分析，为云上黑山羊品种的推广利用进行实时监控提供了分子理论基础。

1.1 材料

1.1.1 样品采集 选用云上黑山羊核心育种群3 个不同育种群的668 只山羊作为实验材料，每只羊采用edta-k2抗凝真空采血管采集静脉血液3～5 ml，-20℃保存，样本品种名、样品数量及采集地点如表1 所示。

表1 样本信息表

1.1.2 主要实验试剂 基因组dna 提取纯化试剂盒（blood dna kit）购自omega bio-tek 公司，真空采血管购自三力医学科技发展有限公司，rna 酶购自北京天根生物公司产品，无水乙醇、异丙醇，均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 dna 提取和检测 按照omega dna 试剂盒操作程序从血液样品中提取dna，获得的dna 溶液用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，初步检测dna 提取效果，合格的产物再用nano 核酸蛋白分析仪进一步检测吸光度和浓度。筛选260/280 值在1.7～2.0 之间、浓度大于50 ng/μl 的样品，存储于-20℃冰箱备用。

1.2.2 引物设计 根据欧洲生物信息学研究所（embleb）发布的snp 位点序列数据库，使用assay design 3.1引物设计软件进行pcr 反应和单碱基延伸引物设计，交由苏州泓迅生物科技有限公司进行引物合成，25 个位点的引物信息见表2。

表2 25 个snp 位点质谱检测引物信息表

1.1.3 snp 分型 将符合质量标准的dna 溶液交由北京康普森农业科技有限公司，采用massarray 时间飞行质谱列阵技术完成snp 位点的基因型检测和分析。

pcr 扩增：在点样孔中加入1 μl 基因组dna，4 μl pcr 反应混合液。反应条件为：94℃2 min；94℃20 s，56℃30s，72℃60s，45 个循环；72℃3min。

虾碱性磷酸酶（sap）反应：在点样孔中加入2 μl sap 反应混合液。sap 反应混合液的组成为1.53 μl ddho，0.17 μl sap buffer（10×），0.3 μl sap 酶。反应参数设定：37℃40 min，85℃5 min。反应完成，温度降至室温后4℃保存。

单碱基延伸反应：在点样孔中加入2 μl 单碱基延伸反应混合液。反应体系总体积9 μl，其组成为：0.755 μl ddho，0.804 μl extend primer mix，0.2 μl iplex buffer plus，0.2 μl iplex terminator，0.041 μl iplex 酶。反应参数设定：①94℃预变性30 s；②94℃变性5 s 后，以52℃退火5 s 加上80℃延伸5 s 为一组循环5 次；③步骤②重复40 个循环；④72℃延伸3 min。⑤全部完成后4℃保存。树脂脱盐纯化：将9 μl 反应产物用水稀释为27 μl，让树脂与反应物充分接触脱盐，再经过低速旋转和离心获得纯化后的反应产物。

质谱分析：纯化后的延伸产物移至spectrochip（sequence）芯片上，使用maldi-tof 质谱分析，每个分型实验至少重复2 次，检测结果使用typer 4.0（sequenom）软件分型并输出结果。

1.1.4 统计分析 利用genalex 6.5计算观测等位基因数（na）、有效等位基因数（ne）、观测杂合度（ho）、期望杂合度（he）、shannon 指数（i）、近交系数（）、遗传变异系数（）、基因流（nm）、nei 氏遗传距离及群体一致度等遗传多样性相关参数；利用cervus 3.0 软件计算多态信息含量（pic）；利用mega 4构建upgma 系统聚类图；利用structure v2.3.3分析群体结构；利用p v1.07进行mds 分析，r 软件（v2.13.1）绘制主成分图。

2.1 snp 位点分析 运用massarray 核酸质谱分型系统进行分析，本实验共获得668 个样本在25 个snp 位点上的16 700 个基因型数据，检出率在64.67%～100%之间，平均检出率93.04%。分型数据用于后续分析。

2.2 群体遗传多样性分析

2.2.1 snp 位点遗传多样性分析 由表3 所知，弥勒和寻甸2 个群体所有位点上的na 值均为2，只有团结乡群体在s13、s27、s28、s30 4 个位点上na 值为1，所有位点平均na 值在1.667～2.000 之间，其中，s13、s27、s28、s30 4 个位点上的na 值为1.667，其余位点均为2.000；25 个位点在3 个山羊群体的ne 值最高和最低都在团结乡群体中，其中团结乡群体的s6 最高，s13 最低，所有位点平均ne 值范围在1.036～1.919 之间，最高的是s5 位点，最低的是s30 位点。

表3 3 个山羊群体在25 个snp 位点上的基因数

25 个snp 位点的杂合度和多态性分析如表4 所示，25 个位点平均ho 为0.035～0.535 之间，最高为s6 位点，最低为s30 位点；平均he 为0.033～0.478，最高为s5位点，最低为s30 位点；平均i 为0.074～0.671，最高为s5 位点，最低为s30 位点；平均pic 值在0.047～0.375之间，最高为s11 位点，最低为s30 位点。

表4 3 个山羊群体在25 个snp 位点上的遗传杂合度及多态性

2.2.2 群体间遗传多样性分析 运用genalex6 软件计算群体3 个核心群的遗传多样性数据如表5 所示，3 个群体的pic 值在0.210～0.227 之间，均小于0.5；shannon 指数在0.372～0.432 之间，均小于1；ho 在0.210～0.240 之间；he 在0.260～0.276 之间；值在0.099～0.188 之间。

表5 3 个山羊群体多态性分析

2.3 群体间亲缘关系分析

2.3.1 pca 主成分分析 将668 个样本的25 个snp 位点进行pca 主成分分析，以主成分1 和2 作为坐标，应用r 软件（v2.13.1）绘制群体结构散点图，以红、绿、蓝 3 种颜色分别标注hm、hx、hy 3 个群体的不同个体。从分析结果（图1）可以看出，云上黑山羊3 个群体的亲缘关系紧密，大量重叠，没有明显形成独立亚群。

图1 云上黑山羊群体结构分析图

2.3.2 系统进化树分析 应用mega4 软件分析668 个样本的基因型数据结果，采用邻接法构建出分支nj 进化树，如图2 所示，3 个群体的个体交叉混杂在一起，没有明显聚集成簇。

图2 668 个样本的nj 聚类图

2.3.3 structrue 分析 通过structure 2.3.4 软件对668 个山羊个体进行群体遗传结构分析，根据下列公式分析：

k 值对应的Δ k 的曲线图如图3 所示，当k 值为4 时，Δ k 达到最大。structrure 软件群体分析结果如图4 所示。

图3 Δ k 计算结果

图4 在k=4 假设下云上黑山羊3 个群体的遗传结构图

2.3.4 群体间的遗传分化 由表6 可知，寻甸群体与弥勒群体之间的变异系数最小，寻甸群体与团结乡群体之间的变异系数最大，但均小于0.05；弥勒群体与寻甸群体之间的nm 最大，寻甸群体与团结乡群体之间的nm最小，数值都远大于1。

表6 3 个山羊群体的fst 和hm

由表7 可知，3 个群体之间的遗传一致度均超过97%，其中弥勒群体与寻甸群体的一致度最高，遗传距离最小；寻甸群体与团结乡群体之间的一致度最低，遗传距离最大。

表7 3 个山羊群体的nei’遗传距离和群体一致度

2.3.5 群聚类分析 应用mega 7 软件构建3 个群体的upmgae 系统聚类图如图5 所示，结果表明，弥勒群体与寻甸群体聚为一支，再与团结乡群体聚为一支。

图5 3 个山羊群体upmage 聚类图

本研究首次通过massarray 时间飞行质谱技术研究云上黑山羊遗传多样性，snp 位点平均检出率高达93.04%，取得了较好的检测效果。通过位点的多态性分析，计算群体中的基因频率、na、ne、he、ho、pic、、nm 等信息，研究群体的遗传组成和遗传规律，获得云上黑山羊核心群的遗传多样性分析结果与实际生产情况相符，说明massarray 时间飞行质谱技术非常适合山羊遗传多样性和群体结构分析。

3.1 snp 位点遗传多样性分析 本研究中，25 个snp位点中有21 个snp 位点在3 个群体中检测到2 个等位基因，有4 个snp 位点在团结乡群体中只检测到1 个等位基因，所有有效等位基因数都小于实际观测基因值，提示这些等位基因在群体中的分布不平衡。根据bostein 等人关于pic 值的评价标准，本研究有10个位点pic 值在0.25～0.5 之间，属于中度多态位点；其余15 个位点的pic 值小于0.25，属于低度多态位点，表明本研究选取的25 个snp 位点有一定遗传多态性。snp 通常表现为纯合子和杂合子2 种状态，而微卫星可以表现大于二态性的多态性，所以在以往的研究中，云南山羊群体的微卫星pic 值均大于0.5，具有更高的遗传多态性。但snp 在基因组上的密度比微卫星更高，遗传稳定性更强，某些突变可能直接影响蛋白质结构或表达水平，结果可供进一步研究分析。

3.2 群体分析 从3 个群体的平均等位基因数的计算结果看，弥勒群体和寻甸群体相同，而与团结乡群体有差异。3 个群体的平均观测等位基因数均小于等位基因数，差异最大的是寻甸群体，表明3 个山羊群体均受到了人工选育，遗传变异较小。杂合度是随机抽取2 个样本的等位基因不相同的可能性，he 主要是根据种群中的优势等位基因的分布频率来推算，群体遗传多样性越丰富，群体一致度越低，he 的值越高；反之，群体遗传多样性丰富度越低，群体的遗传一致度越高，则he 越低。群体处于遗传平衡状态时，群体的ho 越接近he。本研究中的3 个群体中，寻甸群体的遗传丰富度最低，弥勒群体的遗传丰富度最高。3 个群体的ho 都高于he，说明都存在杂合体缺失的情况，其中差异最大的是团结乡群体，受品种改良的影响较大；最小的是寻甸群体，群体结构较为稳定。shannon 信息指数是反映群体遗传多态度的指标，用来估算群体多样性的高低，i 值越大，表示群体的变异越大；i 值越小，表示群体的同质性更高。本研究显示3 个群体的i 值都小于1，说明云上黑山羊核心育种群有较高的遗传一致度，具有较为稳定的品种遗传特征。根据pic 的衡量标准，本研究3 个群体的遗传多样性较低（pic＜0.25），说明这3 个云上黑山羊核心群体的整体遗传多样性较低，其中寻甸群体最低，其次为团结乡群体，弥勒群体最高。

本次研究的3 个核心群体遗传结构分析结果与兰蓉研究的云南黑山羊新品种10 个群体相比，遗传多样性相对较低。这是在新品种培育过程中为提高品种一致度而造成的必然结果。

3.3 群体间的遗传分化代表不同群体之间的遗传分化水平，根据wright 的研究，的数值是0～1，越小，2 个群体之间的分化程度越高，当＜0.05 时，群间几乎不存在分化；在0.05～0.15 间为中度分化；在0.15～0.25 间为高度分化。主要反映了群体内的近交程度，当出现正值时，表明群体内存在近交；反之则存在远交。nm 反应了不同群体之间的基因交流情况，当nm＜1 时，基因交流较少，群体更趋于分化；nm＞1时，基因交流较多，群体之间的基因流动使得发生的遗传漂变能够抑制遗传分化，群体趋于均质化。本次研究的3 个群体值均小于0.05，群体间几乎无分化，基因交流较多，其中弥勒群体与寻甸群体之间的分化最小，基因交流最大（16.636）；寻甸群体与团结乡群体之间的分化最大（0.30），基因交流最小（8.018）；近交系数均为正值，说明3 个群体都存在不同程度的近交。

3.4 聚类分析 遗传距离是通过计算不同群体在同一基因座位上的等位基因频率来估计群体间的遗传差异大小的指标，通常用遗传系统树加以表达。本次研究的3个群体之间遗传距离都非常小，弥勒群体和寻甸群体之间的遗传距离最小，遗传一致度最高达99.1%；寻甸群体和团结乡群体遗传距离最远（0.024），遗传一致度97.7%，3 个群体的遗传一致度非常高，品种遗传特征稳定。聚类分析将弥勒群体与寻甸群体作为一个亚分支，与团结乡群体分开，表明相对团结乡群体，弥勒群体与寻甸群体在遗传上更为接近。

3.5 进化分析 pca 多因素分析、structure 群体结构分析、聚类图是3 个分析群体进化关系的方法，经常被应用在群体遗传关系多样性研究中。pca 分析显示，弥勒、寻甸、团结乡3 个核心群相互重叠聚集在一起，揭示3个群体的个体在遗传分化上较为接近，hm 和hx 群体的个体之间在育种上有极其相近的遗传背景。通过进化树分析群体中个体间的遗传分类关系，发现3 个群体的668 只山羊个体并没有明显的分类，交叉混杂在一起，不同群来源的个体并未聚集成簇。用structure 软件进一步分析群体结构，参照evanno 等的实验步骤，考察个体在群体中的杂交和混血情况。根据k 值最大似然值计算结果，大致分为4 个遗传来源。从遗传构成来看，3 个山羊群体之间基因交流频繁，遗传背景相近，说明核心育种场的基因交流频繁，群体相对均衡，这与pca 分析、进化树分析结果高度一致。

综上所述，云上黑山羊核心群体整体遗传多样性较低，遗传一致度较高，群体遗传构成较为均衡，遗传分化度较小，遗传距离很近，近交系数非常高，说明云上黑山羊核心育种群经过多年培育选育，品种的均一性强，群体差异多来自于品种内部，在今后的生产中，需要注意保持品种的遗传多样性，以减少近交带来的危害。另一方面，在3 个群体中，弥勒群体和寻甸群体有更为一致的遗传特征，而与团结乡群体有较多分化，同时团结乡群体的遗传多样性最低，杂合体缺失程度最高，在今后的生产中需要防止该群体品种生产性能退化。

本研究首次使用massarray snp 质谱阵列基因分析技术对云上黑山羊3 个核心群的遗传结构进行了系统分析，发现云上黑山羊核心群在基因组水平上具有良好的品种一致度和较好的群体稳定性，今后仍需利用分子标记对群体遗传结构进行定期监控，保持云上黑山羊不同核心群的品种遗传均衡，以防近交衰退和品种一致度降低的现象出现，减少近交导致的有害基因积累效应。本研究为云上黑山羊种质资源评价利用和差异化品系培育提供了分子理论基础，在品种应用推广中具有指导意义。