李祥坤，曾道曙，罗超维，谢 莉，吴林溪，李 华，向 海

（佛山科学技术学院，广东省动物分子设计与精准育种重点实验室，生命科学与工程学院，广东佛山 528231）

随着生长性能的遗传改良和饲养水平的持续提高，优质鸡生产面临着腹部脂肪过度沉积的问题，导致鸡肉品质和饲料转化效率下降。通过人工选择培育体脂沉积量适中、群体均一度高的优质鸡，是重要的发展方向。鸡腹部脂肪沉积属于中高等遗传力性状。筛选和鉴定显著影响鸡脂肪沉积水平的功能基因，开发新的分子标记或潜在靶标，是高效培育低腹脂沉积水平优质鸡的重要途径。目前，已有多个基因被报道参与调控脂肪的形成和分化，如过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator activated receptor gamma，）、转录因子固醇调控元件结合蛋白1（sterol regulatory element binding tran ion factor 1，）和-ccaat 增强子结合蛋白（ccaat enhancer binding protein alpha，）3 种转录因子的表达水平与脂肪前体细胞分化显著相关，并通过影响靶标成脂基因的表达调节家鸡机体的成脂过程。

研究发现，还可以通过介导脂肪酸合酶（fatty acid synthase，）的表达，影响脂肪酸合成代谢通路进而调节鸡肝脏的脂肪代谢。另一方面，有研究报道鸡腹部脂肪沉积水平与胰岛素样生长因子1（insulin like growth factor 1，）基因的snp 位点c.-366a＞c和瘦素受体（leptin receptor，）突变体rs13684622（c1002r）有关。最近研究表明，酰基辅酶a 合成酶长链家族成员1（acyl-coa synthetase long-chain family，）、低密度脂蛋白受体相关蛋白4（low density lipoprotein receptor-related protein 4，）、磷脂酸磷酸酶1（lipin1，）和等基因的甲基化修饰，通过调节脂肪酸合成和代谢通路水平影响鸡的腹脂沉积。

天农麻鸡作为清远麻鸡的商品代，在优质鸡市场受到消费者的广泛欢迎，然而生长后期腹脂快速沉积严重影响其经济效益。本研究以上市天龄不同腹脂沉积水平的天农麻鸡为研究对象，利用qrt-pcr 方法定量检测腹部脂肪组织中多个与脂肪沉积相关基因的表达水平，探讨这些基因与天农麻鸡腹部脂肪沉积的关系，以期为天农麻鸡腹脂沉积性状的遗传改良提供参考。

1.1 实验样本 实验动物选自广东天农食品集团股份有限公司提供的200 只商品代天农麻鸡母鸡，在相同条件下进行标准化饲养至126 日龄，然后在温度约10℃的室内屠宰和分离腹部脂肪，对腹脂称重后立即取少量组织于无酶冻存管并立即置于干冰中密封暂存，后转移至-80℃保存备用。屠宰程序按中华人民共和国国家标准（gb13078-2001 和gb/t17237-1998）和农业行业标准（ny5148-2002-ny5151-2002）进行。

1.2 引物设计与合成 根据参考文献筛选出与鸡脂肪合成和沉积相关的10 个功能基因，以为内参，使用primer-blast（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi? _loc=blasthome）设计跨外显子的荧光定量引物，引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。基因信息和引物序列见表1。

表1 荧光定量pcr 引物序列

1.3 rna 的提取和反转录 根据腹脂率对所有实验个体排序，随机选择不同腹脂率的32 个个体，使用南京诺唯赞（vazyme）生物科技有限公司fastpure cell/tissue total rna isolation mini kit 提取腹脂组织的总rna，并利用核酸浓度测定仪对总rna 进行初步质检。利用诺唯赞hi iii rt supermix for qpcr（+gdna wiper）反转录试剂盒进行反转录，反应体系如下：总反应体系20 μl，1 μl 总rna，4 μl 4 × gdna wiper mix，11 μl rnase-free ddho，4 μl 5 × hi iii qrt supermix。pcr 反应条件为：42 ℃2 min，37 ℃15 min，85℃5 s。反转录产物置于4℃保存备用。

1.4 qrt-pcr 检测 利用诺唯赞chamq universal sybr qpcr master mix 进行荧光定量qpcr 检测，反应体系如下：10 μl 2 × chamq universal sybr qpcr master mix，0.4 μl primer1（10 μmol/l），0.4 μl primer2（10 μmol/l），0.8 μl cdna，8.4 μl rnase free ddho，总反应体系共20 μl。pcr 反应条件为：95℃预变性30 s，95℃预变性5 s，60℃退火/延伸15 s，40 个循环。熔融曲线分析：95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s。每个样品设置3个重复。

1.5 数据统计与分析 采用qrt-pcr ct 值比较法（2）计算候选基因相对表达水平。ct 值为荧光量与荧光阈值线交叉时的循环数。计算公式如下：

采用excel 软件计算腹脂率和基因表达量均值，采用均值±标准误格式展示，利用spss 20.0 软件（spss science,chicago，il，usa）双变量相关分析计算腹脂率和基因表达量的相关性（pearson 相关系数）以及单因素方差分析duncan's 法计算极端组间基因表达量的显著差异性，运用graphpad prism 8.2.1 软件作图。

2.1 候选基因表达水平及其与腹脂率的相关性分析 本研究通过qrt-pcr 检测了10 个脂肪沉积候选基因在32 只天农麻鸡腹部脂肪中的表达水平。分别计算10个候选基因的表达量与腹脂率的pearson 相关性系数发现（表2），基因表达量与腹脂率相关性最高（=0.448），呈极显著正相关；和基因次之（分别为0.409 和0.365），均呈显著正相关；基因表达量与腹脂率相关性较高（=0.339）并呈正相关（=0.058），其余6 个基因表达量与腹脂率相关性较低（=-0.172～0.167）且均未达显著水平（＞0.1）。

表2 腹脂率与各基因表达水平相关性分析

2.2 候选基因表达水平在不同腹脂沉积水平组间的比较根据腹脂率高低将天农麻鸡分成4 组（表3）：高脂组（腹脂率6.19%～4.64%，hh）、偏高脂组（4.47%～2.98 %，mh）、偏低脂组（2.96%～2.43 %，ml）和低脂组（2.42%～1.03 %，ll），其中高脂组腹脂率是低脂组的3.07 倍，偏高脂组腹脂率是低脂组的1.98 倍，偏低脂组腹脂率是低脂组的1.46 倍，另外两两组别之间的腹脂率比值分别为：1.55 倍（hh/mh）、1.36 倍（mh/ml）、1.46倍（ml/ll）。

表3 高低腹脂率分组表

比较候选基因在梯度腹脂沉积水平组间的表达模式（图1），可见基因和基因的表达量随着腹脂率降低而呈现由高至低的趋势，提示其可能在调控脂肪沉积上发挥一定作用。在hh 组中表达量较高，在其他3 组中表达水平相当；基因则在ll 组中表达量较高，在其他3 组中表达水平相当，提示这2 个基因的表达水平对天农麻鸡腹脂沉积的影响可能存在一定的阈值效益。

图1 高脂、偏高脂、偏低脂和低脂组腹脂样品中基因的相对表达水平示意图

2.3 高腹脂率与低腹脂率组间基因表达水平显著性分析为了进一步分析候选基因的表达量规律，按照腹脂率从高到低选取腹脂率最高的12 个体（h）和最低的12 个体（l）作为2 个极端组进行基因表达量显著性分析（图2）。h 组平均体重为1 351.26 g，腹脂率5.05%，l 组平均体重为1 302.63 g，腹脂率2.04%，h 组腹脂率是l 组腹脂率的2.48 倍。结果显示，和基因表达量在两极端组间差异显著；其余基因表达量在两极端组间差异不显著（＞0.05）。

图2 极端组腹脂样品中的相对表达水平示意图

脂肪沉积性状是优质鸡肉品质评价的重要指标。减少腹部脂肪沉积，降低腹脂率是天农麻鸡生产中亟待解决的重要问题。本研究结果表明，高脂组腹脂率是偏高脂组的1.55 倍，偏高脂组腹脂率是偏低脂组的1.35 倍，偏低脂组腹脂率是低脂组的1.45 倍，同时部分候选基因的表达水平在梯度腹脂沉积水平组间呈现出一定的规律，其中基因和基因表达量均在hh、mh、ml 和ll 组中依次降低，说明这4 个候选基因可能在天农麻鸡腹脂沉积性状中发挥稳定的调控作用。

是配体激活转录因子的核受体家族成员，是哺乳动物和鸟类脂肪生成的主要调节因子，其不仅促进胚胎期脂肪细胞增殖，而且在脂肪分化过程中也有关键调控作用。研究表明，直接与转录中介体亚基1（mediator complex subunit 1，）结合促进棕色脂肪细胞生成，还能通过结合pr 结构域锌指蛋白16（pr domain zinc finger protein 16，）的锌指结构域激活的转录功能，进一步促进棕色脂肪的合成。本研究中，在不同腹脂率天农麻鸡腹脂组织中的表达量趋势与孟和和王丽的结果一致，提示其可能对天农麻鸡腹脂沉积的调节作用具有一定的理论依据。

为了进一步研究候选基因表达水平与天农麻鸡腹脂率之间的关系，本研究将腹脂率与基因表达量进行相关性分析，鉴定出和的表达量与腹脂率呈现显著正相关性。接着选取腹脂率最高的12 个体（h）和最低的12 个体（l）作为2 个极端组对10 个候选基因表达量进行组间显著性分析，发现和的表达量在极高、极低组中均差异显著。另外，和基因在两极端组中的表达量趋势符合它们在机体内的作用，也符合先前的报道结果。

基因是水解vldl（极低密度脂蛋白）中tg（甘油三酯）的主要酶，是参与脂肪代谢的关键酶，也是脂肪细胞中甘油三酯衍生脂肪酸吸收和存储的限速酶。禁食实验表明，大鼠肝脏基因表达量升高，但是在饥饿大鼠腹脂中基因表达量下降，在饥饿处理之后重新投食的绵羊和奶牛的腹脂中又升高，基因的表达在脂肪沉积中具有很强的组织特异性和物种特异性。本研究中，基因表达量在高脂组腹部脂肪中高于低脂组，这一结果与前人报道鸡腹脂基因mrna 表达水平与腹脂率呈显著正相关（＜0.05）一致。基因属于pat 蛋白家族成员，是脂滴表面主要结构蛋白，其调控脂肪细胞的脂质代谢和脂肪沉积，并且维持着脂滴的形成和保护脂滴免受水解。souza 等用过量表达的peri a 和peri b 阻碍3t3-l1 细胞系中肿瘤坏死蛆因子增加脂解功能的发挥，证明了可以保护脂滴免受水解。而当被蛋白激酶a（pka）磷酸化，会冲破阻挡脂肪酶接触脂滴的屏障，从而分解tg，因此控制磷酸化是脂肪分解的重要开关。本研究基因表达量在高脂组腹部脂肪中高于低脂组，与赵小玲的研究结果相似。基因又称脂肪和肥胖相关基因，是人类发现的第一个与非病理性肥胖相关的基因。小鼠缺失导致出生后生长迟缓，脂肪组织和体重显著减少，还通过控制能量消耗在功能上参与能量稳态，突变导致小鼠血清水平降低，以及的过度表达引起小鼠食物摄入量增加，导致肥胖。据前人研究报道，基因在动物脂肪组织中高表达，但在母鸡腹部脂肪中研究较少。本研究结果显示，基因在极端高脂组中表达量高于极端低脂组并呈显著差异，表明基因可能在天农麻鸡母鸡腹脂中起着脂肪沉积调控作用。也有报道基因在人皮下脂肪组织中存在脂肪分解作用，但是其在物种和脂肪组织区域之间存在着差异性，具体的调控作用需要更进一步研究。

、、和表达量随腹脂率增加而逐渐高表达，其中、和表达量与腹脂率呈显著正相关且表达量在极端组间差异显著，可能是正向调节天农麻鸡腹部脂肪沉积的重要候选基因。