唐 标，吴 静，王静鸽,3，郑 雪，吉小凤，钱鸣蓉，杨 华*

(1. 浙江省农业科学院 农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室，浙江 杭州 310021；2. 浙江省农业科学院 农产品质量安全与营养研究所，浙江 杭州 310021；3. 青海大学 农牧学院，青海 西宁 810016)

肉鸡和蛋鸡的养殖在我国畜牧养殖业中占据重要地位。不同品种的鸡在不同地方的生长环境、养殖规模、养殖设备不仅影响鸡的品质，还影响其粪便的微生物组成。蛋鸡多笼养，活动范围小；肉鸡养殖模式多样，既有散养也有笼养。因此两者的饲养方式以及养殖环境均大有不同。养鸡行业的集约化生产，带来了可观的经济效益，同时也产生了大量的排泄物。鸡粪通常作为肥料、饲料及沼气发酵被利用起来，但是鸡粪中具有许多病原菌、寄生虫卵、重金属及抗生素残留等有毒有害物质，对人类健康和环境构成潜在威胁。因此，在进行养殖场粪便资源化再利用的同时，深入研究不同种类的养鸡场粪便的菌群结构具有必要性。很多学者对鸡粪菌群结构进行了报道，邓雯文等用16s rdna高通量测序技术研究鸡粪菌群变化，发现在门水平，各组均以厚壁菌门()、变形菌门()、拟杆菌门()3个菌门为主，对样品中潜在病原菌菌属进行分析，结果发现，拟杆菌()、不动杆菌()、假单胞菌()等13个菌属在鲜鸡粪中有较高的丰度。王学静等的研究表明散养鸡的益生菌丰度高于笼养鸡，而笼养鸡的致病菌丰度高于散养鸡。造成鸡肠道或粪便微生物菌群差异变化因素较多，因此，在不同地区和养殖环境下，引起蛋鸡和肉鸡粪便菌群差异性的原因还需进一步探究。

本研究基于16s rdna扩增子高通量测序技术，对浙江省部分养鸡场粪便中的微生物菌群进行分析，研究了蛋鸡与肉鸡的菌群结构的差异，结合不同养殖场的不同养殖方式、饲养环境等因素，明确了蛋鸡和肉鸡的微生物菌群结构和差异性，对优化养殖方式及粪便资源化利用具有重要参考价值。

随机选取浙江省养鸡规模较大的5个县市的养鸡场，共采集53个样品。在杭州市富阳区(fy)散养的白羽肉鸡场采集粪便样品14个，在桐庐县(tl)某散养肉鸡仙居鸡场采集粪便样品14个，两个肉鸡场均采用散养模式。在杭州市余杭区(yh)某蛋鸡厂采集海兰白粪便样品10个；在温州市(wz)某养殖厂采集京红1号蛋鸡粪便样品8个；在台州市天台县(tt)某蛋鸡场采集海兰褐蛋鸡粪便样品7个，另外此养殖厂在喂养时添加了壳聚多肽。三个蛋鸡场均为笼养模式，样品为养殖场的蛋鸡和肉鸡的新鲜粪便，取样后干冰保存并运回实验室，置于-80 ℃冰箱保存备用。

用粪便dna提取试剂盒(qiaampfast dna stool mini kit)提取所采样品的总dna，具体提取方法参考说明书。每个粪便样品称取180～220 mg提取dna，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组dna的完整性，nanodrop 2000分光光度计用于评估所提样品中dna浓度与纯度。

采用引物338f 5'-actcctacgggaggcagcag-3' 和806r 5'-ggactachvgggtwtctaat-3' 对16s rdna的v3-v4区进行扩增，pcr扩增体系(总体积为20 μl)：2.5 mmol/l dntp 4 μl，338f和806r各1 μl，rtaq buffer(10×)2.5 μl，rtaq 酶0.3 μl, ddho 11.2 μl。pcr扩增程序：95 ℃预变性 3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环；72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，对于符合条件的pcr产物进行纯化回收，回收产物采用 truseqtm dna sample prep kit建库试剂盒进行文库构建，利用illumina mi-seq平台(美吉生物医药科技有限公司，中国上海)进行上机测序。

使用美吉生物云在线平台(www.majorbio.com)进行数据分析。测序得到的原始数据经过质量评估，对序列质量进行质控和过滤区分样本，用uparse 7.0.1090进行操作分类单元 (operational taxonomic unit，otu)聚类，用usearch 7.0进行otu统计，otu数量可以代表样品物种的丰度，从而进行高通量测序数据统计与质量分析；利用mothur软件计算每个样品的otu数量，根据coverage指数、chao1指数、ace指数、shannon指数和simpson指数进行α多样性分析；利用qiime 1.9.1计算门到种水平的丰度进行菌群结构分析及组间差异分析。

53份样品共产生3 027 200条有效序列。平均长度为437 bp，由图1a可见，测序序列数大于30000时，曲线上升缓慢，表明测序深度与数据量合理，测序数据量继续加大，只会产生少量新的otu。

在各分类水平上统计各样本的菌群，共获得20个门，44个纲，93个目，175个科，425个属，712个种1523个otu。由图1b可知，蛋鸡otu总数为1352，肉鸡otu总数为1332。蛋鸡独有的otu数为191，肉鸡独有的otu数为171，两组样品在微生物菌群组成上存在差异。

图1 16s rdna高通量测序数据质量与统计fig.1 16s rdna high-throughput sequencing data quality and statistics

coverage指数代表了样品的覆盖率，所有样本的coverage指数均大于0.99，说明测序结果可信。ace指数和chao1指数代表菌群的丰度，tl肉鸡场的样品中ace指数和chao1指数分别为612.70、609.99，均高于三个蛋鸡场的样品，这可能与肉鸡场的散养方式有关。simpson指数越大，多样性越低。其中两个蛋鸡场wz和tt的平均simpson指数(0.17、0.10)均低于两个肉鸡场fy和tl(0.32、0.14)。shannon指数和菌群的多样性正相关，shannon指数越大，说明多样性越高，各组样本在otu水平的shannon指数如图2a所示。

三个蛋鸡场的平均shannon指数(yh、wz和tt: 3.35、3.79、3.78)均高于两个肉鸡场fy和tl(1.73、3.25)。如图2b所示，蛋鸡粪便的shannon指数极显著高于肉鸡(