陈 婷，张起伟，辛俊宝，代创科，黎倩倩，倪春霞

(杨凌金海生物技术有限公司，陕西 杨凌 712100)

口蹄疫(foot-and-mouth disease，fmd)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,fmdv)引起的多发于猪、牛、羊等偶蹄目动物的一种急性、烈性、热性、高度接触性传染的疾病。世界动物卫生组织已将其列为a类传染病之首，对畜牧业发展和人类食品卫生安全造成巨大威胁。注射口蹄疫疫苗是目前预防猪、牛、羊感染口蹄疫最便捷、最有效的手段。绝大多数地区、国家仍采取以免疫灭活疫苗为主的防控措施。

口蹄疫灭活疫苗是一种以细胞培养技术为载体制备口蹄疫病毒液，并将病毒液彻底灭活，获得口蹄疫抗原的疫苗制备方式。因此，灭活疫苗的安全性、免疫效果的稳定性、对动物的保护率是评定口蹄疫疫苗质量的重要指标。

为了解口蹄疫灭活疫苗免疫动物后的免疫效果、免疫安全性及免疫持续期，准确掌握口蹄疫灭活疫苗对牛的保护情况，本文选用口蹄疫o型、a型二价灭活疫苗(ohm/02株+akt-iii株)免疫接种6～9月龄口蹄疫阴性牛，监测免疫后的nsp抗体水平，评估疫苗免疫的安全性及纯度。同时，持续测定免疫后动物的口蹄疫o型、a型抗体水平，评估疫苗的免疫效果及抗体水平持续期，并对免疫牛进行攻毒保护，评估疫苗免疫的可靠性。

口蹄疫o型、a型二价灭活疫苗(ohm/02株+akt-iii株)，厂家：杨凌金海生物技术有限公司。

6～9月龄口蹄疫抗体阴性牛(elisa)，共16头，其中12头用于免疫，4头作为对照。

口蹄疫o型、a型抗体液相阻断elisa检测试剂盒购于兰州兽研科技有限公司(原中国农业科学院兰州兽医研究所)，口蹄疫非结构蛋白3abc抗体检测试剂盒购于北京金诺百泰生物技术有限公司。

随机抽取口蹄疫o型、a型二价灭活疫苗(ohm/02株+akt-iii株)三瓶，测定疫苗146s抗原含量、总蛋白含量及内毒素含量，混匀后用于免疫。对免疫组牛进行两次免疫，免疫牛舌背面皮内各分20点注射灭活疫苗，每点注射0.1 ml，共2 ml。一次免疫28 d后对免疫牛进行二次免疫。方法同一次免疫。免疫时间从第一次免疫后开始计算。

在免疫期间持续观察、记录免疫牛的身体状况，并在免疫不同阶段(免疫后5 d、28 d、56 d)对牛采血，使用口蹄疫非结构蛋白3abc抗体检测试剂盒对血清进行口蹄疫非结构蛋白(nsps)抗体测定。

使用口蹄疫o型、a型抗体液相阻断elisa检测试剂盒(免疫后5 d、28 d、56 d、85 d、110 d)牛血清进行口蹄疫o型、a型抗体水平测定。

攻毒测试在本单位动物房生物安全三级防护区进行，选用ohm/02株、a/xjnc/2010株强毒对免疫后110 d免疫牛及对照牛做攻毒测试。免疫组牛分两组，分别于舌上皮下两侧分两点分别注射强毒ohm/02株(10id50/0.2 ml)、a/xjnc/2010株(10id50/0.2 ml)，连续观察10 d，计算疫苗对免疫牛的保护率。

免疫用疫苗质量测定如表1，第一次免疫用疫苗146s抗原平均含量为21.7 μg/头份，总蛋白均值138 μg/ml, 内毒素含量含量均小于0.25 eu/头份，二次免疫用疫苗146s抗原平均含量为21.9 μg/头份，总蛋白均值129 μg/ml, 内毒素含量含量均小于0.25 eu/头份，符合注射要求。免疫后持续观察免疫牛、对照牛牛舌、口腔粘膜、乳房和蹄部等可能产生口蹄疫症状的部位，在整个免疫阶段，免疫牛、对照牛均未出现口蹄疫症状。在免疫后5 d、28 d、56 d对牛血清进行口蹄疫非结构蛋白(nsps)elisa测定(表2)，免疫牛、对照牛nsps抗体均为阴性。

表1 免疫用疫苗146s抗原含量、总蛋白含量、内毒素含量检测结果table 1 results of 146s antigen content, total protein and endotoxin content of immune vaccine

表2 免疫组免疫后nsps抗体水平检测结果table 2 the levels of non-structural protein (nsps) antibodies after the immunization group were immunized

免疫前、免疫持续期牛血清口蹄疫o型、a型抗体水平测定结果如图1所示，在免疫后28 d口蹄疫o型、a型抗体水平均出现明显上升。口蹄疫o型抗体在免疫后28 d抗体水平达到最大值，28 d免疫组牛二次免疫后，口蹄疫o型抗体水平持续保持在较高水平。口蹄疫a型抗体在免疫后56 d抗体水平达到最大值，并在后期保持较高水平。口蹄疫o型抗体效价在免疫28 d后均显著高于a型抗体效价，并在免疫后28 d呈极显著差异。根据试剂盒判定标准，牛抗体效价大于等于1∶128，动物99%以上保护效力，在免疫后28 d，免疫组o型平均抗体水平高于99%以上保护线，并在整个免疫持期维持在较高水平。免疫组a型平均抗体水平在免疫后28 d接近99%以上保护线，在免疫后56 d高于99%以上保护线，并在免疫持续后期维持在较高水平。

图1 疫苗免疫持续期免疫组口蹄疫持续性o型、a型抗体效价*差异显著(p