(内蒙古化工职业学院，内蒙古 呼和浩特 010010)
摘 要：从阿尔巴斯绒山羊及蒙古绵羊血中提取基因组dna，根据已报道的bmp2基因的保守序列设计上下游引物，扩增山羊及蒙古绵羊的bmp2基因部分序列，将此片段克隆到pmd18-t载体中，筛选阳性克隆，提取质粒dna，并进行序列测定，并将两者序列进行比对。结果山羊该核苷酸片段与蒙古绵羊的同源性达99%，另与genbank中人、小鼠、牛、绵羊的同源性分别为87%，85%，98%和99%。说明该基因在不同物种间具有较高的保守性，尤其是山羊与绵羊之间具有更高的保守性。
关键词：骨形态发生蛋白；基因克隆；序列分析
中图分类号：s827∶s826.8＋2  文献标识码：a  文章编号：1007—6921(2008)06—0064—03

绒山羊的皮肤和毛囊结构特征不仅是其生物学特征的重要内容，而且对其主要产品—绒毛产量和品质产生直接的重要影响。关于绒山羊绒毛生长机理的研究热点，尹俊、李长青、张燕军等在绒山羊的毛囊发育、生长周期及皮肤基因的表达作了大量的研究〔1～7〕。bmp（bone morphogenetic protein）,即骨形态发生蛋白,是1965年urist〔8〕对脱钙骨基质的成骨研究中发现的。bmp是一组能在骨骼外异位诱导软骨和骨形成的分泌型蛋白质,其组成不少于20种〔9〕。通过研究发现,bmp家族决定家畜不同时期的生长发育,骨骼形成,并且是毛囊发育涉及的信号分子之一。毛囊形态发生的起始信号源于真皮〔10〕，真皮细胞和上皮细胞之间相互作用，导致两个细胞群体的有序增殖和分化，并最终形成完整的毛囊〔11〕。最近已报道bmp2与小鼠次级毛囊的发生有关。关于绒山羊和蒙古羊毛囊发育与bmp2的关系还未见报道。本实验克隆绒山羊与蒙古羊bmp2基因片段，目的在于研究bmp2基因在绒山羊和绵羊毛囊发育过程中的表达情况，为进一步阐明绒毛生长的机理奠定基础。 
1 材料与方法
1.1 实验材料

阿尔巴斯绒山羊血液采自内蒙古阿白羊场，蒙古绵羊血液采自侯先志教授实验牧场。基因组dna提取试剂盒、质粒小提试剂盒、载体pmd18-t、ex taq dna聚合酶、iptg、x-gal、氨苄青霉素、lambder dna/ecori+hindiii、dl100均购于takara公司。其他试剂皆为国产分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 基因组dna的提取方法。按照takara公司血液基因组dna提取试剂盒说明书基因组dna ，灭菌三蒸水溶解，-20℃保存。
1.2.2 pcr引物的设计与合成。根据人、鼠、绵羊、牛的bmp2基因的保守序列，设计引物，由大连宝生物基因技术公司合成，引物序列如下：
f ：5  aat  agc  agt  ttc  cat  cac  cga  att  3
r ：5  gag  gcg  ttt  ccg  ctg  ttt  gt  3
1.2.3 pcr扩增条件。pcr反应的总体积为20μl，含1.5mmol/lmg2＋，10×buffer，50ng模板dna，dntp的终浓度为75μmol/l，引物终浓度为0.4μmol/l，2.5μtaqdna聚合酶。pcr扩增条件：94℃  5min，94℃ 1min，55℃ 1min ，72℃ 1.5min，循环30次，最后72℃延伸5min。pcr产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.4 pcr产物的克隆。将pcr产物连接到pmd18-t载体，转化已制备好的e.coli dh5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素、iptg、x-gal的lb培养基平版上，37℃温箱培养16～20h。
1.2.5 阳性克隆的筛选和鉴定。挑取白色单菌落于10ml含氨苄青霉素的lb培养液中，37℃,150rpm/min，振荡过夜。取20μl菌液快速筛选阳性克隆〔12〕，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。筛选滞后条带作为重组子，按质粒提取试剂盒操作说明提取质粒dn