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mtDNA异质性及其法医学应用

栏目:医学论文发布:2009-03-27浏览:2633下载234次收藏
【关键词】mtdna;异质性
【中图分类号】d919.2
【文献标识码】b
【文章编号】1007—9297(2006)02—0140—04
线粒体dna(mitochondrial dna,mtdna)是惟一
的细胞核外dna。人类mtdna为一裸露的环状双链
结构,长16569 bp,由富含嘌呤的重链(h链)和富含
嘧啶的轻链(l链)组成。mtdna编码区的序列相对保
守,其非编码区长1 122 bp,又称为控制区。控制区的
碱基变异相对集中分布在15996~16401nt和29~408
nt两个区段,分别称为hv i和hvli。后来,lutz等【l】
发现在438~574nt间也存在较多的碱基变异,称为
hvⅢ。mtdna呈母系遗传特征,加之其拷贝数多、突
变率高、抗腐败能力强,具有极高的法医学应用价值。
个体发育源于一个受精卵,理论上同一个体所有
的mtdna序列应是一致的。但实际却发现有少数同
一个体的mtdna碱基序列并不完全相同。这种同一
个体mtdna出现两种或两种以上的碱基序列的现象
称为异质性(heteroplasmy)。121其在人体的存在表现为
同一个体不同组织、同一组织不同细胞或同一细胞不
同线粒体之间存在不同的mtdna序列。

、mtdna异质性形成的可能机理
mtdna异质性发生机制至今还不是很清楚
hauswi~h和laipis(1982)在研究牛线粒体dna多态
性时发现异质性线粒体dna在卵母细胞和胚胎早期
发育阶段发生快速分离的现象,从而提出线粒体dna
遗传的瓶颈理论。[31后来人们多用该理论来解释
mtdna异质性的形成原理。
mtdna异质性的本质是突变.即突变型和野生型
mtdna以不同比例共存,其发生与mtdna拷贝数多、
不对称复制及缺乏校正修复机制等密切相关。瓶颈理
论认为:卵母细胞在分化成卵细胞及形成受精卵的过
程中,卵母细胞和受精卵中数千个mtdna子集合群
体(不同序列mtdna混合),似通过瓶颈一样的阻塞
作用而使各个mtdna子集合群体数量明显减少,只
有少数mtdna进行选择性复制,故一种突变基因型
可以占优势并固定出现在下一代中。ashley等[41发现
该“瓶颈理论”结果与人类mtdna相似,即在单个个
体中异质性的大小可以改变,子代可以有不同的基因
型,仅仅两三代异质性就可以转为同质性。
共存的突变型和野生型mtdna通过减数分裂或
有丝分裂随机分布到子代细胞中,由此细胞中突变型
和野生型mtdna比例随之发生随机增减,也称遗传
渐变,最终,再分裂的子代细胞有向全部为突变型或
野生型mtdna。即同质体的方向发展的趋势,该过程
称为“复制分离”。随着复制分离和遗传渐变的发生,
一些mtdna中选择作用不明显的突变建立起同质
体.并以一定的频率保留于人群中.形成mtdna某些
区段的多态性。然而,一些重度突变因复制分离造成
的同质体个体极易因自然选择而淘汰。因而,多数重
度突变无法建立起同质体,表现为异质体,异质体在
人群中往往只能建立较低频度的多态性。
遗传瓶颈出现在卵细胞形成过程中的推测后来
得到了证实。bendall等【5i研究了180对双胞胎,其中
发现4例有异质性。采用遗传渐变理论模式推算,估
计减数分裂的代间瓶颈大约有2至,100个分子.对于
特定的母子间传递的mtdna估计有3~2o个分子
作者计算人mtdna—hvi的突变和固定的率在1.2x
1o ~2.7×10-5/每代、每位点之间,相当于1个转位
突变/2500年至1转位突变/55000年的范围。调查结
果与其他文献报告基本相符,说明遗传瓶颈相对比较
狭窄,形成了一种制约因素。调查结果也证实,不同的
母系间的瓶颈大小确有差异。
一个成年人体内mtdna估计有一兆,mtdna复
制聚合酶缺乏忠实性,受精后的细胞发育过程中出现
变异,形成组织间mtdna型别差异的可能性的确存
在。有研究发现原胚层组织异质性是一致的,胎儿各
组织型别一致,但到了成人,不同组织的异质性分布
【作者简介】翟仙敦(1977一),女,山西临汾人,硕士研究生,助教,主要从事法医遗传学研究。tel:+86—027—83692645;e—mail:san—
mao506@ 163.corn 。
法律与医学杂志2006年第l3卷(第2期)
出现差异。tully等(1998)用dgge方法检测21名成
年人不同组织如血、骨、毛发、肝、肌肉,发现异质性出
现的程度有差异,有的容易检出 有的不能检测。研究
资料显示,在细胞分化、发育过程中,也可有mtdna
控制区碱基变异。实验观察组织问异质性的发生存在
与卵细胞形成过程中类似的瓶颈,ciafaloni等发现同
一个体不同组织变异型与野生型mtdna出现率有差
异,证实了组织问存在异质性的分离。例如某妇女,经
过多次提取口腔拭子和血样,检测出异质性,同个体
头发材料,5根是16355t,3根是16355c,2根是两种
型的混合物。提示在细胞分化、发育过程中也可能存
在另一种瓶颈。
二、mtdna异质性的类型及好发位置
异质性按其存在形式分为点异质性和长度异质
性两类,它既可发生在代问也可发生于代内。正常人
mtdna异质性高发于控制区,而编码区几乎没有。[61
通常,异质性序列之间差异仅限于某一个碱基,称
为点异质性。同时出现两个位置碱基序列不同的概率
虽小,但仍有报道:而同时出现3个或者3个以上的
情况至今尚未见报道。mtdna序列变异主要是复制过
程中碱基错配,其中转换占90%以上。少数是颠换。点
异质性主要集中于hvi和hvii。hvi碱基转换类型
多发生在嘧啶之间,约为80%。hvii的转换碱基中,
嘧啶与嘌呤约各占一半。颠换多发生于c和a之间.
并几乎都集中在hvi。人群中点异质性的发生率因检
测方法的灵敏度不同而差异很大。hvi 16 189nt碱基
替换的发生率很高,其中t—c转换高达l5%。
长度异质性主要发生于hvi 16184 16193 nt
和hvii 303—315 nt的c—stretch区,表现为c数目
的差异。在序列测定时可观察到16 189 nt和310 nt
后多个信号峰交叠形成的模糊序列,即“手指样结
构”。[71根据anderson序列,c—stretch分别于16 189 nt
和310nt被t阻断,可能由于复制滑动引起的相同碱
基单调连续趋势,该区被认为是突变的热点 而这一
趋势产生了长度异质性。bendall等[8】也认为长度异质
性形成原因主要是dna 复制滑动。无关个体问
mtdna长度异质性差异较大,根据hvii 303 309
nt碱基c数目的多少,可分为单纯同质性(c7)、轻度
异质性(c8为主)、明显异质性(c8和c9为主)和t—c
转换后序列失控(c10一c14)4种。hvi 16 189nt约
l5%的t—c转换中又有66%形成长度异质性。[91与
hvi不同,hvii的t很少缺失。由此认为hvii的长度
异质性机制是c在303—309 nt区域内的插入和复制
滑动,形成3lont p c的转换。同一母系中,与16 189
· l4l ·
突变相关的长度异质性,分布和变化相对稳定,但无
关个体问差异很大。bini等[1ol研究发现异质性长度c
的个数与c—stretch上游的a碱基数目呈负相关,相
对于c数目的不稳定性,同一个体a数目恒定,这一
发现对家系分析和法医学领域中包括单根毛发在内
的组织比较有较大意义。一般而言,如果c—stetch区
的c多于8个,就会增加长度异质性的几率。⋯1
通常.骨骼肌和神经组织的异质性水平相似,毛
发中相对较高.外周血的异质性最低。[121
三、mtdna异质性检测方法
(一)测序
序列测定是检测mtdna多态性和异质性最常用
的方法。尽管一直以来测序被认为是检测突变的金标
准,但若异质性水平低于20%该方法即很难检出,这
也是先前普遍认为异质性发生率很低的原因。克隆后
测序又比pcr产物直接测序更可靠,因其可排除因
pcr过程中taq dna聚合酶滑脱造成的序列改变。
对hvii轻链测序发现,由于临近c—stretch区产生的
长度异质性使3lont的异质性比率达50%,这是一种
普通的人为假象,通过对重链的测序可消除该假象。[131
因此为避免可能存在的影响,mtdna高变区序列测定
要求对重链和轻链进行双向测序,并至少重复一次。
(二)序列特异性寡核苷酸(aso)探针杂交
pcr—aso分析技术先用pcr扩增得到靶dna
片段,再用aso探针与目的dna扩增片段杂交.阳性
结果说明靶dna含有与探针相应的等位基因。尽管
pcr—aso分析技术有操作简单、灵敏度高、特异性好
等优点,但目前所用特异性探针较少,系统的个人识
别能力有限是其局限性之一。多重pcr特异性寡核苷
酸片段用于检测突变链,可以发现小于l%的异质性,
然而等位特异性扩增很容易受pcr初始熔链温度的
影响,易发生错误的扩增,且无法估计异质性的数量。
(三)限制性片段长度多态性(restriction 哪ent
length polymorphism,rflp)分析
在mtdna高变区,大约有2/3的碱基变异涉及限
制酶识别位点,故可用rflp检测点异质性。与直接测
序相比,荧光rflp分析较低程度的异质性更灵敏一
些。但应注意避免因不完全消化而导致错误的结论。
(四)单链构象多态性(single strand conformation
polymorphism,sscp)分析
pcr—s
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