兔巴氏杆菌-波氏杆菌二联蜂胶疫苗的

研制及安全、效力试验

兔多杀性巴氏杆菌病(pm)和兔支气管败血波氏杆菌病(bb)是家兔的两种主要细菌性传染病,它们传播迅速,一旦在兔场暴发流行,很难根除,经济损失惨重。进行疫苗接种是预防这两种疾病的最有效的措施。免疫原性好的菌(毒)种和良好的免疫佐剂是保证疫苗免疫效力的必要条件。因此,在pm和bb基础菌种研究的基础上,对蜂胶的提取工艺进行了研究,选取了蜂胶乙醇提取液的水溶物作为佐剂,研制疫苗,并进行了疫苗的安全及效力试验。现将该研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 仪器及材料

1.1.1 菌种 兔多杀性巴氏杆菌pm90株(对家兔的致死剂量为8-10个活菌,对小鼠的致死剂量为100个活菌);兔支气管败血波氏杆菌bb82株(对小鼠的致死剂量为1×107个活菌,对家兔的致病剂量为1×108个活菌)。

1.1.2 试验动物 不同日龄的健康大耳白兔

1.1.3 培养基 含3%小牛血清的马丁琼脂平板(sms)、马丁肉汤(mb)、硫乙醇酸盐培养基(t.g)、酪胨琼脂(g.a)、葡萄糖蛋白胨汤(g.p)等。

1.1.4细胞瓶

1.1.5 蜂胶

1.1.6 仪器 gq(f)—75管式分离机、索氏回流装置、温控式旋转蒸发器

1.2 试验方法

1.2.1 pm90菌液的制备及检验

1.2.1.1一级种子的繁殖与鉴定 用灭菌生理盐水适当稀释pm90株第9代冻干菌种,接种于0.1%绵羊血红素的马丁琼脂平板(bms)上,37℃培养18h,然后选取5-10个典型菌落,分别接种于10%绵羊鲜血琼脂斜面若干,同上培养后,作为一级种子。在4℃保存,可使用7日。继代次数不超过3代。

1.2.1.2二级种子的繁殖及鉴定 将pm90株一级种子接种于适量马丁肉汤中,置37℃振荡培养18h,取样用sms培养基作纯粹检验;置4℃保存,可使用3日。

1.2.1.3制苗用菌液的培养 将pm90株二级种子接种于sms培养基,37℃培养18h,无菌水洗下菌苔,取样做纯粹检验,同时用平板菌落计数法计算菌液浓度,将菌液浓度调整为200×108个/ml。

1.2.1.4菌液的灭活 加入0.4%的甲醛溶液于菌液中,容器密封后,37℃灭活48h,其间振摇6-8次,然后进行灭活检验。本研究灭活检验及无菌检验用的培养基为:sms、t.g、g.a和g.p。置37℃条件下培养48h,无细菌生长说明已完全灭活。

1.2.1.5菌液的离心、冻融 灭活检验合格的菌液用管式分离机离心除去甲醛,无菌刮下菌苔,用等量的灭菌生理盐水配成原浓度的菌液。小量分装后反复冻融3次,再次进行无菌检验。

1.2.2  bb82菌液的制备与检验  将bb82株第7代冻干菌种接种于bms培养基上,37℃条件下培养24h,然后选5-10个典型菌落,分别接种于10%绵羊鲜血琼脂斜面若干,同上培养后,作为一级种子。置4℃保存,可使用7日。继代不超过3代。二级种子的繁殖以及制苗用菌液的培养、灭活、离心及冻融参照1.2.1

1.2.3 蜂胶佐剂的制备 经过工艺优化选择,我们采用了醇提水溶法来制备蜂胶佐剂。蜂胶原胶在-20℃冰柜中冷冻过夜使变脆,取出后研磨粉碎,放入深色瓶中,按1：4的比例加入80%的乙醇,充分搅拌,置70℃索氏回流2h