孙 科， 王 萌， 冯希勇

(徐州生物工程职业技术学院药品食品学院，江苏徐州 221006)

根结线虫(spp.)是一种寄生性植物病原线虫，能侵染3 000多种植物，对世界农业危害严重，每年约造成1 000 亿美元的损失。其中，南方根结线虫()是危害我国农作物及蔬菜的优势种，也是牛蒡种植中重要的虫害，亟需安全有效的防治措施。由于化学农药对生态环境的破坏越来越严重，我国对化学农药的使用限制也越来越严格，绝大多数杀线剂我国已经禁用。生物防治根结线虫病是减少化学农药危害实现绿色环保的重要途径。目前，许多学者做出了有意义的探索与研究，分离筛选得到多种拮抗根结线虫的生防菌，其中真菌比例最大，如哈茨木霉()、厚垣轮枝孢菌()、淡紫色拟青霉()等。芽孢杆菌()是一类重要的植物病虫害生防菌，具有抗逆性强、功能多样、亲和性好等特性。目前，芽孢杆菌对根结线虫的防治研究逐渐增多，gao等发现蜡质芽孢杆菌()s2的发酵产物鞘氨醇对南方根结线虫以及秀丽杆线虫具有较强的致死性。史凤玉等研究发现，巨大芽孢杆菌()以及解淀粉芽孢杆菌()的次生代谢产物具有显著的杀灭根结线虫的能力。虽然筛选出的根结线虫的生防菌种类较多，但真正用于实际生产中极少，因此，挖掘新的根结线虫生防菌仍然具有重要意义。

随着时间的推移，植物病虫害发病严重的田块会出现病虫害减轻的现象，并成为自然衰退现象，研究学者把具有自然衰退现象的土壤成为抑制性土壤。研究者认为之所以会出现病虫害自然衰退现象，是因为土壤中存在大量病虫害天敌，特别是一些拮抗微生物。因此，利用牛蒡根结线虫自然衰退现象的抑制性土壤筛选根结线虫拮抗剂，为寻找根结线虫生物防治提供了一条新的途径。本研究从江苏省徐州市丰县、沛县牛蒡种植南方根结线虫病自然衰退的土壤中，筛选南方根结线虫生防菌，并研究生防菌发酵产物对南方根结线虫的作用机制，以期为牛蒡根结线虫病的绿色防治提供理论和实践依据。

1.1.1 样本来源 从徐州市丰县、沛县种植牛蒡的9个镇，选取根结线虫发病严重的牛蒡大田中采集生防菌芽孢杆菌样本。南方根结线虫由徐州市绿色植保工程技术研究中心提供。

试验时间为2019年3月至2020年11月，试验地点为徐州生物工程职业技术学院生物发酵研究中心和江苏省徐州市沛县牛蒡生产基地。

1.1.2 培养基 lb固体培养基：nacl 10 g，酵母提取物 5 g，胰蛋白胨 10 g，琼脂18 g，去离子水 1 000 ml，ph值为6.8～7.2。121 ℃灭菌20 min，培养基冷却到50～55 ℃，加入过滤的放线菌酮20 mg。

lb液体培养基：lb固体培养基配制过程中去掉琼脂和放线菌酮。

1.1.3 供试牛蒡品种 牛蒡品种为新林-徐州1号，由徐州山崎农产品技术研发有限公司提供。

1.1.4 检测试剂盒 总糖含量测定试剂盒、过氧化氢酶(cat)活性检测试剂盒、总蛋白(tp)含量测定试剂盒、羧酸酯酶(ces)活性检测试剂盒、乙酰胆碱酯酶(ach)活性检测试剂盒，均购自上海酶联生物科技有限公司。

sw-cj-1fd单人单面超净工作台，购自上海沪净医疗器械有限公司；fa1004b-2204b万分之一电子分析天平，购自青岛聚创华业分析仪器有限公司；qm-qx-20l行星球磨机，购自长沙米淇仪器设备有限公司；ms-3漩涡混合仪，购自上海巴玖实业有限公司；shp-80d生化培养箱，购自上海森信实验仪器有限公司；sn5000splus紫外可见分光光度计，购自青岛精诚仪器仪表有限公司；tg16g离心机，购自常州市亿能实验仪器厂；hwy-2112b立式双层恒温摇床，购自苏州威尔实验用品有限公司；g-12k离心机，购自济南泰医生物技术有限公司。

1.3.1 生防菌筛选 把采集的9份样品各取10 g加入装有90 ml无菌生理盐水的250 ml三角瓶中，80 ℃、180 r/min水浴加热60 min，取1 ml菌悬液加入装有9 ml无菌生理盐水的试管中，充分振荡，按此方法进行浓度梯度稀释。取10、10、10浓度的菌悬液0.1 ml进行平板涂布，每个浓度3次重复。在28 ℃恒温箱中倒置培养2 d，挑取平板上细菌单菌落划线纯化，将纯化的单菌落接种于试管斜面，4 ℃保藏备用。

挑取分离纯化的试管菌种接种到lb液体培养基中，28 ℃、200 r/min培养18 h制成种子液。以2%接种量进行发酵液制备，28 ℃、200 r/min发酵 48 h。将发酵液在12 000 r/min离心10 min，上清液用0.22 μm滤膜过滤，取上清液备用。

用2% naclo溶液对根结线虫卵囊块消毒，25 ℃ 恒温箱中孵化5 d获得根结线虫二龄幼虫。在96孔板上每孔加入30头根结线虫二龄幼虫，同时滴入 200 μl 过滤发酵液，进行毒力测定，每株菌株进行3次重复，并用lb液体培养基对照。25 ℃恒温培养，24、48、72 h后用显微镜观察根结线虫的存活状况。判断线虫死亡的标准为针触碰不动为死亡个体。死亡率计算公式如下：

死亡率=线虫死亡数/线虫总数×100%；

校正死亡率=(处理线虫死亡率-对照线虫死亡率)/(1-对照线虫死亡率)×100%。

1.3.2 盆栽试验 将牛蒡种子在0.2% kmno溶液种浸泡30 min后，用无菌水洗涤5次。放置于底层铺满吸水滤纸的培养皿中萌发。把发芽的牛蒡种子种植在装有无菌培养土的花盆中，当牛蒡长出4张真叶时，在距根5 cm处灌入10 ml发酵过滤液，5 d后每盆接入含有约3 000头根结线虫悬液 3 ml，同时用0.5%阿维菌素进行比较，对照组接入5 ml无菌水，每个菌株设置3次重复。温室大棚中培养50 d，拔出牛蒡植株，用无菌水反复冲洗根部，统计根结数量。根据文献[14]，确定根结指数和防治效果。

1.3.3 菌株鉴定 把筛选出的菌株在lb培养基平板上培养并观察菌落形态，革兰氏染色后进行显微观察，并进行生理生化试验。同时利用细菌总dna提取试剂盒对筛出的菌株进行基因组提取，采用16s通用引物进行分析比对，利用系统进化分析及分子鉴定软件mega 7.0.14进行系统发育进化树构建。

1.3.4 抗根结线虫菌株的生防机制研究 取根结线虫卵囊块，用1%naclo溶液表面消毒2 min，用无菌水冲洗3～5次，在25 ℃恒温箱中培养孵化，用无菌生理盐水把孵出的二龄幼虫配成2万头/ml悬浮液，备用。

发酵滤液用乙酸乙酯萃取、减压蒸馏、真空冷冻干燥，制成冻干粉。用去离子水配制成浓度为5、10、15 μg/ml发酵产物溶液，保存于4 ℃冰箱。

在1.5 ml离心管中加入100头南方根结线虫二龄幼虫，同时加入500 μl浓度为5、10、15 μg/ml的发酵产物溶液，在25 ℃恒温箱中培养，分别于12、24、36、48 h后在离心管中加入1 ml缓冲液于冰浴中匀浆，对照组加入无菌lb液体培养基，4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，取上清液。利用相关试剂盒测定发酵滤液对根结线虫二龄幼虫体内总糖、总蛋白降解情况，并检测发酵滤液对南方根结线虫体内羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶及过氧化氢酶等活性的影响，每个处理3次重复。

从9个镇牛蒡种植区共筛选出产芽孢的细菌72株，通过制备细菌发酵过滤液作用于南方根结线虫的卵囊及二龄幼虫，从表1可以看出，8株细菌的发酵过滤液对南方根结线虫二龄幼虫校正死亡率大于65%，其中lb-16菌株的发酵过滤液对线虫的校正死亡率最高，达到了86.24%，菌株lb-24、lb-07、lb-36、lb-59发酵过滤液对线虫的校正死亡率>70%，分别达到了80.19%、76.57%、74.83%、71.53%。同时测定了细菌发酵过滤液对南方根结线虫卵孵化的影响，可以看出，菌株lb-16对线虫卵孵化抑制率最高达到82.24%，相对应的孵化率为11.75%。孵化抑制率大于75%的菌株还有lb-24、lb-07、lb-36，抑制率分别为76.83%、77.67%、79.96%，对应的孵化率分别为15.37%、14.62%、13.67%。因此，挑选lb-16、lb-24、lb-07、lb-36等4株菌株进行盆栽试验。

表1 不同细菌发酵滤液对南方根结虫卵孵化率和二龄幼虫死亡率的影响

从盆栽试验结果(表2)可以看出，菌株lb-16发酵滤液灌根处理后牛蒡的根结指数较小，防治效果最好，高于0.5%阿维菌素的防治效果。菌株 lb-24 的防治效果为63.58%，菌株lb-07的防治效果为59.92%，防治效果都大于50%。同时，菌株lb-16的株高和鲜质量与ck相比显著增加。由此可见，菌株lb-16的生防效果最好。

表2 盆栽试验结果

菌株lb-16在lb固体培养基上菌落呈白色、不透明，边缘为不规则圆形，革兰氏染色呈阳性。从表3可以看出，菌株lb-16与短短芽孢杆菌的生理生化反应具有相同的特征。将菌株lb-16的16s rdna pcr扩增产物进行琼脂凝胶电泳检测，获得扩增片段大约约 1 500 bp，与原核生物的16s rrna片段大小相符。把扩增产物回收纯化，进行基因序列测定。测序结果在ncbi数据库中比对，选取重叠率大于98%的菌株构架系统发育树。从图1可以看出，短短芽孢杆菌() strain cans-411(kt580607.1)与菌株lb-16的同源性最近，并处在同一分支中。结合菌株的形态特征、生理生化特征及16s rdna基因分子鉴定结果，菌株lb-16是和短短芽孢杆菌亲缘关系较近的一种芽孢杆菌。

表3 生防菌lb-16生理生化特性

2.4.1 菌株lb-16发酵产物对南方根结线虫体内总糖含量的影响 由图2可知，发酵产物处理过的线虫体内总糖含量明显低于对照组，并且随着发酵产物浓度的增加总糖含量逐渐下降，随着作用时间的延长总糖含量也迅速降低，而对照组的总糖含量随着线虫的生长逐渐增加。48 h时，对照组线虫的总糖含量达到54.16 μg/ml，而15 μg/ml发酵产物处理的线虫总糖含量只有4.78 μg/ml，前者是后者的11.33倍。说明菌株lb-16的发酵产物具有明显的抑制南方根结线虫糖代谢的作用，限制了线虫体内糖的积累，从而抑制了线虫的正常生命活动。

2.4.2 菌株lb-16发酵产物对南方根结线虫体内总蛋白含量的影响 由图3可知， 经过发酵产物处理过的线虫总蛋白含量与对照相比明显降低，随着发酵产物浓度的增加，总蛋白含量降幅也在增加，随着作用时间的延长，总蛋白含量逐渐减少，且总蛋白含量变化趋势和总糖含量变化趋势基本一致。48 h时，对照组的总蛋白含量达到了 118.24 μg/ml，而15 μg/ml发酵产物处理的总蛋白含量只有 4.58 μg/ml，前者是后者的25.82倍。对照组的总蛋白含量呈上升趋势， 表明线虫蛋白质代谢正常，体内蛋白质不断积累，而试验组蛋白质代谢受到破坏，体内总蛋白积累明显减少，影响了线虫的正常生命活动。

2.4.3 菌株lb-16发酵产物对南方根结线虫体内乙酰胆碱酯酶活性的影响 由图4可知，发酵产物处理过的线虫体内乙酰胆碱酯酶活性相对于对照组受到明显抑制，随着发酵产物浓度的增高乙酰胆碱酯酶活性明显下降。15 μg/ml浓度处理的酶活性最低，基本没发生变化(24 h时酶活性略有增加)。5 μg/ml浓度处理下酶活和对照组差异不明显，10 μg/ml浓度处理的乙酰胆碱酯酶活性降幅最大。48 h时，15 μg/ml浓度处理组的酶活性比对照组下降了77.24%，说明菌株lb-16发酵产物能明显抑制乙酰胆碱酯酶活性，造成根结线虫神经系统紊乱，从而影响线虫的正常生命活动。

2.4.4 菌株lb-16发酵产物对南方根结线虫体内过氧化氢酶活性的影响 由图5可知，对照组的过氧化氢酶活性随着时间的延长呈逐渐增加的趋势，但处理组的过氧化氢酶活性随着发酵产物浓度的增加和处理时间的延长呈现出明显的降低趋势，在12～24 h酶活性降幅较大。15 μg/ml浓度处理组的酶活性最低且基本不随时间变化而变化，5、10 μg/ml 浓度处理组酶活性下降幅度大致相同。48 h时，15 μg/ml浓度处理组的酶活比对照组下降了84.07%，说明菌株lb-16发酵产物能明显抑制过氧化氢酶活性，干扰根结线虫正常代谢，影响线虫正常的生命活动。

2.4.5 菌株lb-16发酵产物对南方根结线虫体内羧酸酯酶活性的影响 由图6可知，对照组的羧酸酯酶活性呈逐渐增加趋势，且随着时间的延长，酶活性增幅也在增加。5 μg/ml浓度处理组羧酸酯酶活性比对照组略有降低，但变化幅度较小。10 μg/ml 浓度处理组羧酸酯酶活性比对照组有较大幅度的降低，而15 μg/ml浓度处理组的羧酸酯酶活性最低，且随时间变化的幅度很小。48 h时，15 μg/ml 浓度处理组酶活性比对照组下降了93.75%，说明菌株lb-16发酵产物能明显抑制羧酸酯酶活性，降低线虫正常代谢功能，影响其正常的生命活动。

分离和筛选高效生防菌是进行南方根结线虫生物防治的关键，本试验从根结线虫发病严重并逐渐转轻的田块中筛选出72株产芽孢的细菌，通过制备发酵滤液进行根结线虫卵和二龄幼虫的毒力试验，筛选出4株毒力较强的细菌。用筛选出的4株细菌发酵滤液进行盆栽灌根试验，最终筛选出毒力最强的菌株lb-16，经过形态特征、生理生化特征及基因检测鉴定为和短短芽孢杆菌亲缘关系接近的芽孢杆菌，研究结果丰富了南方根结线虫的生防资源。

目前，枯草芽孢杆菌()和解淀粉芽孢杆菌在根结线虫的防治中被广泛应用，短短芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌亲缘关系较近，但短短芽孢杆菌在南方根结线虫防治研究中却鲜有报道。目前，对短短芽孢杆菌的研究主要集中在代谢产物抑菌性方面。王洁等以短短芽孢杆菌为研究对象，采用deae-52阴离子交换层析等方法对其产生的蛋白进行分离纯化及鉴定，发现该蛋白的抑菌谱较广可抑制常见的植物病害真菌。龚国利等从美国黄石国家公园筛选出1株耐高温的短短芽孢杆菌，对其发酵产物进行初步研究，发现该物质具有良好的抑菌活性。本研究筛选出的芽孢杆菌lb-16发酵滤液通过盆栽灌根对牛蒡根结线虫病的防治效果达到73.61%，比市售阿维菌素防治效果高出5.14%，表现出较强的根结线虫生防潜力，同时显著增加了牛蒡的鲜质量和株高。下一步将对菌株lb-16的发酵产物用于牛蒡大田中根结线虫的防治进行研究，为开发该菌株的牛蒡生物有机肥提供理论及实践依据。

本研究结果表明，芽孢杆菌lb-16的发酵产物能够显著降低南方根结线虫二龄幼虫的乙酰胆碱酯酶、过氧化氢酶以及羧酸酯酶的活性。乙酰胆碱酯酶活性的降低，能够破坏根结线虫的神经传递，抑制了线虫的活动能力。同时，乙酰胆碱酯酶是一些农药如有机磷类的靶标酶，羧酸酯酶是许多药物的解毒酶，芽孢杆菌lb-16诱导的靶标酶和解毒酶与许多农药的靶标酶和代谢酶系是一致的，这与杨秀娟等研究的3种植物乙醇提取物对南方根结线虫卵囊酯酶活性影响的研究结果一致。过氧化氢酶是根结线虫体内重要的抗氧化保护酶，所以芽孢杆菌lb-16的发酵产物能够抑制抗氧化保护酶正常的酶促反应，进而导致南方根结线虫活性降低甚至死亡。同时，研究还发现，短短芽孢杆菌lb-16的发酵产物可以明显降低根结线虫二龄幼虫体内总糖和总蛋白含量。糖和蛋白质是根结线虫体内维持生命的重要组成物质和功能成分，糖类在根结线虫体内是重要的信息传递物质，线虫的化学感受器中含有大量的糖类，糖类含量的降低会影响线虫的趋化性，而蛋白质是线虫身体的重要组成物质及生命过程调控物质，特别是线虫体表角质层的重要组成成分，增加了线虫的抗逆性。因此，芽孢杆菌lb-16的发酵产物可能通过干扰根结线虫糖和蛋白质代谢进而杀死线虫。接下来将把芽孢杆菌lb-16和其他根结线虫生防菌配合使用，以提高对南方根结线虫的防治效果，减少农药对生态环境的破坏。

本研究从牛蒡种植根结线虫病高发田块中分离筛选得到产芽孢的细菌，通过离体毒力测定和盆栽灌根试验获得高效生防菌株lb-16，利用形态学、生理生化特性及基因检测方法将其鉴定为与短短芽孢杆菌()亲缘关系较近的一种芽孢杆菌，并初步研究了菌株lb-16对南方根结线虫的作用机制，结果表明，用菌株lb-16的发酵产物冻干粉溶液处理南方根结线虫，随着浓度的增加，明显降低了线虫体内总糖和总蛋白含量，同时明显降低了乙酰胆碱酯酶、过氧化氢酶和羧酸酯酶的活性，可以为牛蒡南方根结线虫病的生物防治提供依据。