刘文轩，岳子婷，潘 坛，陈 冲，范德成，李 聪*

(1. 西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100；2.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

作为最早被人类利用的动物奶，山羊奶因其营养全面、容易消化等特点越来越受到消费者青睐。西农萨能奶山羊具有遗传性稳定、体格雄壮、泌乳性能好、适应性强等特点，常作为改良国内奶山羊的父本。随着生活质量的不断提高，人们对山羊奶品质尤其是其中蛋白质含量的要求也不断提高。因此，为选育出乳品质优异的奶山羊，挖掘参与调控乳蛋白合成代谢的关键基因，进而解析蛋白质合成代谢的机制通过分子设计育种实现上述目标是有效策略。

丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor, serpin)家族由hunt等于1980年根据卵清蛋白和人抗凝血酶等蛋白的一级结构保守性提出。14(serpin peptidase inhibitor, clade a (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 14)是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的重要成员，主要在孕酮的作用下在牛、羊、猪等动物的子宫内膜分泌。与serpin家族中多数成员不同，serpina14未保留抗蛋白水解活性，且在不同物种中所表达的蛋白质功能各异。目前对14基因的研究主要集中在猪和绵羊上，在山羊上的研究十分有限。在绵羊体内serpina14主要起免疫调节作用，防止胎儿同种异体排斥反应等；在猪体内serpina14通过结合并稳定铁结合蛋白，参与由母体子宫向胎儿的铁的转运。

本试验室前期对6只极端高低乳蛋白率的奶山羊乳腺组织进行转录组测序，鉴定到14基因(log2foldchange=-2.44，p-value=3.85e-03)是影响奶山羊乳蛋白合成的关键候选基因。绵羊serpina14蛋白可抑制与妊娠相关的糖蛋白、天冬氨酸蛋白酶同生长因子的结合。以上研究均表明14基因在奶畜乳蛋白合成中发挥潜在的重要作用。

本研究拟克隆西农萨能奶山羊14基因cds序列并进行生物信息学分析，通过qpcr(quantitative real-time pcr)技术检测基因在不同组织和不同泌乳时期的表达水平，为深入探究14基因调控奶山羊乳蛋白合成与代谢的分子机制奠定前提基础。

选择3岁龄健康西农萨能奶山羊一只，屠宰后采集其肝脏、脾脏、乳腺组织、肾脏、瘤胃、小肠等组织1.5 g左右；选择3只3岁龄健康西农萨能奶山羊，在其不同泌乳时期进行活体采集乳腺组织各0.5 g左右，使用depc水对组织漂洗进行简单处理(除去外层薄膜及残余血迹)，迅速置于液氮中保存，以用于组织总rna提取。

本研究中所用主要试剂与材料如表1所示。

表1 主要试剂与材料table 1 main reagents and materials

1.3.1 引物设计与合成 根据ncbi中山羊14基因序列(登录号：xm_013973196.2)，采用primer premier5.0软件设计克隆pcr引物(片段全长1 311 bp)。f-引物(5'-3')：cggggtaccatgtcccacgggagaatgaa；r-引物(5'-3')：cccaagcttctactcaacttgggggttgag。上下游引物分别带有kpnⅠ和hindⅢ 酶切位点。

1.3.2 西农萨能奶山羊乳腺组织总rna提取及反转录 取乳腺组织0.1 g充分研磨，向研磨液中加入1 ml trizol试剂裂解细胞，按照试剂说明书提取总rna，对提取的总rna用30 μl rnase-free ho进行溶解，经浓度和纯度(od/od≈1.8)测定符合要求后，根据prime rt reagent kit使用说明书，对rna反转录使其成为cdna。

1.3.3 西农萨能奶山羊14基因克隆与测序 以cdna为模板，进行pcr扩增以得到14基因。pcr反应体系为 (20 μl) ：0.2 μl的cdna模板；f-引物、r-引物 (10 μmol/l) 各1 μl；10 μl 的prime star max(含聚合酶、dntps等)；7.8 μl 的ddho。pcr扩增程序为：预变性(98 ℃，3 min)、变性(98 ℃，10 s)、退火(60 ℃，5 s)、延伸(72 ℃，10 s)，按上述程序进行34个循环，之后72 ℃延伸3 min；12 ℃终止反应。配置1%琼脂糖凝胶，电泳检测扩增产物长度，利用上海生工胶回收试剂盒纯化目的片段。构建pmd19t-serpina14克隆载体，连接pmd-19t载体(16 ℃，12 h)。连接体系：脱氧核糖核酸片段(胶回收产物) 7 μl，solution Ⅰ 5 μl，pmd-19t载体0.5 μl。将克隆载体转化感受态细胞dh5α，经氨苄霉素 (amp) 抗性筛选后挑取阳性菌落，对菌液进行pcr鉴定 (pcr反应体系和程序同上)，将扩增产物送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序。

如表2所示，采用生物信息学分析软件和数据库对14基因及其表达的蛋白进行生物信息学分析。

基于对瘤胃、肝脏、脾脏、乳腺、小肠、肾等9种组织以及处于不同泌乳时期乳腺组织提取的总rna，利用实时荧光定量pcr技术检测14基因的mrna表达水平。qpcr反应体系(10 μl)为：sybrpremix ex taq(2×) 5 μl，模板cdna (1 000 μg/μl) 0.8 μl，f-引物、r-引物(10 μmol/l)各0.4 μl，ddho 3.4 μl。qpcr反应条件为：预变性(95 ℃，30 s)、变性(95 ℃，10 s)、延伸(55 ℃，30 s)，循环45次。内参基因为uxt(f：tgtggcccttggatatggtt；r: ggttgtcgctgagctctgtg)，定量引物serpina14(片段全长221 bp)f：ctgcctaatttggaggccctg；r:tcaacttgggggttgaggac；serpina14的组织相对表达量用2法定量，用graphpad prism v7.0.4进行绘图。

表2 生物信息学分析所用软件及数据库table 2 software and data s used in bioinformatics analysis

使用spss 17.0软件处理试验数据，进行one-way anova显著性检验，试验结果均以平均值±标准差表示。当数值