马丽婷, 徐 智, 赵 兵, 陈 妍, 邓亚琴, 王宇蕴

(云南农业大学资源与环境学院 昆明 650201)

堆肥是目前实现农业有机固体废弃物和畜禽粪便资源化利用较为有效的方法之一。然而, 一些植物来源的农业有机废弃物(如玉米秸秆、稻壳等)中的木质素结构复杂, 不易降解。这阻碍了农业有机废弃物的资源化利用。然而, 木质纤维素降解产生的酚类、醌类等是形成腐殖质的重要前体物质,较高含量的木质纤维素及其降解对腐殖质的形成和稳定具有积极作用。而木质纤维素的降解需要大量的水解酶来催化木质纤维素底物的水解。因此,有必要探究一种方法来促进木质纤维素降解酶的产生, 以强化堆肥腐殖化。

堆肥的本质是有机物在微生物和相应酶的作用下转化为稳定、复杂的腐殖酸大分子的过程, 酶在有机废弃物降解过程中发挥着关键作用, 驱动着生物降解过程的矿化和腐殖化过程。木质纤维素降解酶的产生可能是由真菌和细菌共同作用的结果,真菌和细菌产生木质纤维素降解酶的反应与其自身的特性和环境变化有关。真菌能够分泌大量对木质纤维素底物具有催化活性的胞外酶和胞内酶, 且在堆肥过程中木质素等难降解物质主要由真菌在堆肥成熟阶段进行降解。有学者认为, 在堆肥原料中接种微生物是促进酶活性、提高堆肥质量的一种有效方法, 且酶活性的提高可能受特定功能菌群的影响。黄孢原毛平革菌 (phanerochaete chrysosporium)是白腐菌中降解木质素最活跃的有效菌种之一,对木质素的降解独具优势。白腐菌的木质素降解酶系(包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶)是木质素降解系统中的主导酶系。在白腐菌对木质纤维素的降解机制中, 木质素过氧化物酶主要氧化木质素中的非酚型结构, 锰过氧化物酶和漆酶则氧化酚型结构, 各种酶协同作用, 完成对木质素的降解。大量堆肥试验表明, 在堆肥过程中接种黄孢原毛平革菌促进了酶活性, 从而提高了堆肥物料降解效率和堆肥品质。由于黄孢原毛平革菌适宜的培养温度为35 ℃, 在堆肥不同时期接种可能会影响木质纤维素降解酶的产生, 进而影响木质素的深度降解。chen等报道了黄孢原毛平革菌在玉米秸秆和油枯堆肥中的应用, 而黄孢原毛平革菌在畜禽粪便和作物秸秆堆肥不同时期接种对堆肥腐殖化进程的作用尚少清晰报道。

综上所述, 本研究结合黄孢原毛平革菌的耐温特性, 在稻壳鸡粪不同堆肥时期接种黄孢原毛平革菌, 探讨堆肥过程中的酶活性和木质纤维素含量的变化特征, 以期明确堆肥不同时期接种黄孢原毛平革菌对堆肥腐殖化进程的影响。为生物强化高木质素农业废弃物堆肥处理, 促进堆肥腐殖化过程, 提升堆肥产品质量提供技术支撑和理论依据。

试验于云南农业大学资源与环境学院土壤肥料实验室进行。鸡粪取自云南农业大学养鸡场, 风干粉碎后备用。稻壳购买于云南省昆明市晋宁科贸有限公司。试验选用的菌种为黄孢原毛平革菌, 用土豆培养基富集活化培养用于后续试验, 菌悬液含有的黄孢原毛平革菌数量约为10cfu?ml。堆肥原料的基本理化性状如表1。

表1 堆肥原料的基本理化性质table 1 basic physicochemical properties of the compost raw materials

试验设置3个处理: 不接种(t1)、堆肥降温期(第18天)接种黄孢原毛平革菌(t2)、堆肥初期(第0天)接种黄孢原毛平革菌(t3) 3个处理, 每个处理3次重复。t1处理将风干的稻壳和鸡粪按1∶1.27的比例混合, 控制c/n为25, 调节含水量为52%。t2和t3处理分别于不同时期在t1的基础上添加黄孢原毛平革菌(菌液添加重量为总有机物料干重的0.5%)。试验采用堆肥式反应器(100 l)堆肥, 每个反应器并联组成一套曝气系统, 每个堆肥反应器通气速率为6 l?min, 每小时通气3次, 每次2 min。试验发酵时间为36 d, 堆肥前6 d每3 d翻堆一次, 第6～36 天则每6 d翻堆一次。

分别在堆肥0 d、3 d、6 d、12 d、18 d、24 d、

30 d和36 d采用五点采样法在堆体内部均匀取样。每次采样时, 各重复均采集9个样品, 其中3个样品风干粉碎用来测定c/n、木质素含量、纤维素含量,3个样品保存于4 ℃冰箱中用于测定ph、种子发芽率和腐殖质组分相关指标, 最后3个样品保存于—80 ℃冰箱中用来测定酶活性。

每天上午9: 00用水银温度计测定堆体中心温度, 同时测定环境温度并记录; ph、c/n根据文献[7]测定; 种子发芽指数(gi)用水芹(oenanthe javanica)种子根据文献[11]测定, 计算种子发芽指数的公式如下:

木质过氧化物酶(lip)和锰过氧化物酶(mnp)活性按文献[12]测定, 纤维素含量(cc)、木质素含量(lc)的测定参考文献[13], 降解率(dr)的测定参考文献[14]。

腐殖酸含量(hs)、富里酸含量(fa)和胡敏酸含量(ha)按文献[15]测定。

式中: ha-c为胡敏酸碳含量, fa-c为富里酸碳含量,hs-c为腐殖质碳含量, toc为总有机碳含量。

采用spss 19 统计软件和office excel软件进行数据处理及分析, rda 分析利用 canoco 5.0 软件完成。

2.1.1 堆肥温度、ph、c/n和种子发芽指数(gi)的变化

堆体内部温度是表征好氧堆肥发酵过程中微生物活性与有机物料腐熟进程的主要指标, 也是整个堆肥工艺中的关键因素之一。如图1a所示, t1、t2和t3处理均在堆肥第2天进入高温期, 持续高温(≥50 ℃) 时间分别为10 d、12 d和10 d, 均满足高温堆肥的无害化处理标准要求; t2处理在堆肥降温期接种外源黄孢原毛平革菌后, 温度呈先上升后下降趋势, 最高温度达到50.5 ℃。原因可能与降温期的温度是黄孢原毛平革菌繁殖代谢的适宜温度,保证其有效活性, 促进堆体再次发酵有关; 与t1处理相比, t3处理高温持续时间没有明显差异, 说明黄孢原毛平革菌在堆肥初期接种效果不佳。

图1 不同时间接种黄孢原毛平革菌对堆肥过程中堆肥物料理化性质的影响fig.1 changes of physicochemical properties of compost materials during composting with inoculation of phanerochaete chrysosporium in different times

ph是影响微生物活动的重要因素, 是直接反映堆肥内部酸碱程度的重要指标。如图1b所示, 堆肥ph变化范围为6.0～9.0, 整个堆肥过程是一个趋碱的过程。t1、t2和t3处理的ph均在前12 d呈上升趋势, 在12 d时分别为8.98、8.96和8.56。原因可能与高温期(图1a)堆肥能够释放大量的氨有关。随着堆肥进程的持续, t1、t2和t3处理的ph呈逐渐下降趋势, 堆肥结束时, 各处理的ph分别为8.30、8.10和7.59, 这与chen等的研究结果一致。

c/n比通常用来反映堆肥物料的营养平衡状况,同时也是评价堆肥腐熟程度的重要指标之一。如图1c所示, 在整个堆肥过程中, 堆肥处理c/n比均呈下降趋势, 这与chen等的研究结果一致。堆肥结束时, t1、t2和t3处理的c/n比分别为15.36、14.54和14.67, t2和t3处理较t1处理差异显著(p＜0.05)。依据堆肥腐熟要求(c/n＜15), 堆肥结束后,t2和t3处理能够满足要求, 且t2处理最低, 原因是降温期外源接种黄孢原毛平革菌以后, 一定程度上促进了堆体再次发酵(图1a), 使得微生物再次消耗碳源, 降低堆肥c/n值。

种子发芽指数(gi)一直被认为是反映堆肥产品腐熟程度和无害化最可靠、最敏感、最有效的重要指标。当gi＞50%时, 堆料毒性较低; 当gi＞80%,堆料完全腐熟不会影响植株的生长发育。如图1d所示, 堆肥结束时, t1、t2和t3处理的gi值分别为81.24%、95.46%和83.18%。按照腐熟标准gi＞80%要求, 所有处理均能在堆肥结束时达到这一标准。其中t2处理的gi值高于t1和t3处理, 并呈显著差异(p＜0.05), 进一步说明降温期外源接种黄孢原毛平革菌对堆肥进程的强化作用。

2.1.2 堆肥过程中酶活性的变化

图2a表明, 木质素过氧化物酶(lip)的活性呈先升后降趋势, 接种菌剂的t2和t3处理的峰值均高于对照t1处理。堆肥结束时, t1、t2和t3处理lip活性分别为7.60 u?l、29.68 u?l和9.96 u?l;t2处理lip活性显著(p＜0.05)高于t1和t3处理。由图2b可知, 锰过氧化物酶(mnp)活性呈波动上升趋势; t1和t3处理均在堆肥12 d达到峰值, 分别为61.42 u?l和80.51 u?l; t2处理在堆肥36 d达到峰值(92.56 u?l); 3个处理峰值间差异显著(p＜0.05)。与t1和t3处理相比, 在堆肥降温期接种黄孢原毛平革菌显著促进了其后堆肥的lip和mnp的活性。这些结果与chen等、zeng等的研究结果一致。

图2 不同时间接种黄孢原毛平革菌对堆肥过程中堆肥物料酶活性的影响fig.2 changes of enzymes activities of compost materials during composting with inoculation of phanerochaete chrysosporium in different times

2.1.3 堆肥纤维素、木质素及有机物料降解的变化

在整个发酵过程中, 纤维素、木质素含量整体均呈下降趋势(图3a, 3b)。就纤维素含量而言, t1、t2和t3处理分别从初始的0.29 g?g、0.30 g?g和0.28 g?g下 降 至0.19 g?g、0.09 g?g和0.15 g?g(图3a); 木质素含量分别从初始堆肥时的0.23 g?g、0.24 g?g和0.24 g?g下降到0.14 g?g、0.03 g?g和0.07 g?g(图3b)。堆肥结束时, 与t1和t3相比, t2处理木质素含量分别降低78.57%和57.14%, 纤维素含量分别降低52.63%和40.00%, 差异显著(p＜0.05)。有机物料累计降解率在整个发酵过程中呈上升趋势(图3c)。堆肥结束时, t1、t2和t3处理的累计降解率分别为17.09%、30.15%和20.25%; 其中t2处理较t1和t3处理显著增加76.41%和48.89% (p＜0.05),进一步印证了在降温期接种黄孢原毛平革菌对堆肥进程的促进作用。

图3 不同时间接种黄孢原毛平革菌对堆肥过程中堆肥物料纤维素含量、木质素含量和有机物料降解率的影响fig.3 changes of cellulose content, lignin content and organic material degradation rate of compost materials during composting with inoculation of phanerochaete chrysosporium in different times

2.2.1 腐殖质(hs)、胡敏酸(ha)和富里酸(fa)含量的变化

腐殖质(hs)、胡敏酸(ha)和富里酸(fa)含量的变化反映了稻壳鸡粪堆肥的腐殖化过程。堆肥hs含量变化如图4a所示, 在堆肥前期(0～17 d), t3处理hs含量高于其他处理; 而堆肥降温期和腐熟期(18～36 d), t2处理hs含量显著增加, 从36.51 g?g(第18天)持续增加至76.30 g?g(第36天); 堆肥结束时, t2处理hs含量显著高于t1和t3处理(p＜0.05)。

fa是腐殖质中分子量较小、组成简单、活性较高的组分。堆肥过程中fa含量变化如图4b所示, fa含量呈先升高再下降的趋势。堆肥前期(0～17 d), 各处理fa含量呈上升趋势, t3处理fa含量显著(p＜0.05)高于其他处理, 可能与堆肥第0天接种黄孢原毛平革菌有直接关系。在堆肥后期(18～36 d),fa含量总体呈下降的趋势, fa含量的持续降低过程与hs稳定性逐渐增强过程相印证, 这可能是因为在微生物的作用下fa转化形成结构更复杂的ha。t2处理的fa含量从第30天开始下降, 比t1和t3推迟12 d (图4b), 且第36 天fa含量显著高于t1和t2处理(p＜0.05)。这与第18天接种黄孢原毛平革菌促进了木质素和纤维素的降解(图3a, 3b), 产生了新的fa有直接关系。

作为hs的主要成分, 在堆肥过程中, ha含量变化趋势与hs含量变化一致(图4c)。t1、t2和t3处理ha含量从堆肥初期的7.75 g?kg、7.75 g?kg和7.52 g?kg分别上升至堆肥结束时的29.50 g?kg、55.93 g?kg和32.75 g?kg。与t1和t3处理相比,t2处理的ha含量显著增加(p＜0.05)。进一步验证了降温期外源接种黄孢原毛平革菌有助于深化纤维素、木质素的降解, 促进ha的形成。

图4 不同时间接种黄孢原毛平革菌对堆肥过程中堆肥物料腐殖质组分和腐熟指标的影响fig.4 changes of humus components contents and maturity indexes of compost materials during composting with inoculation of phanerochaete chrysosporium in different times

2.2.2 腐殖化率(hr)、胡富比(ha/fa)和胡敏酸百分比(pha)的变化

堆肥腐殖化率(hr)是评价堆肥腐殖化程度的重要指标, hr的增加说明堆肥过程中可溶性有机碳含量增加。如图4d所示, 堆肥过程中hr呈上升趋势; 堆肥结束时, t1、t2和t3处理的hr值分别为25.06%、36.45%和30.43%, 且t2处理的hr显著高于t1和t3处理(p＜0.05)。表明在稻壳和鸡粪堆肥降温期外源接种黄孢原毛平革菌可提升堆肥腐殖化程度。

胡富比(ha/fa)和胡敏酸百分比(pha)是表征堆肥腐殖质品质的重要指标, ha/fa在腐殖化过程中增加说明堆肥过程中小分子的fa转化成了大分子的ha, 增加了腐殖质的复杂程度; pha在腐殖化过程中增加则表明hs结构复杂性增强。堆肥结束时, t2处理ha/fa和pha分别为2.72和73.39%(图4e, 4f), 显著高于t1和t3处理(p＜0.05)。

腐殖质的形成与木质素和纤维素的降解密切相关, 而木质素和纤维素的降解与木质纤维素降解酶的活性密切相关。lip和mnp都属于木质素降解酶系, lip主要氧化木质素中的非酚型结构, mnp则主要氧化酚型结构, 各种酶协同作用, 以ho或o作为电子受体, 能够使木质素结构单元的连接键断裂,使芳香烃结构去甲基化, 从而实现木质素的降解。本研究结果表明, 木质素(lc)和纤维素(cc)含量与木质纤维素降解酶(lip、mnp)的活性呈显著负相关(p＜0.05, p＜0.01) (图5a), 这一结果支持了lip和mnp促进木质素和纤维素降解的观点。另外, 冗余分析(rda)结果表明, 降解率(dr, 解释度=88.2%,p=0.002)、纤维素含量(cc, 解释度=74.3%, p=0.002)和木质素含量(lc, 解释度=72.5%, p=0.002)对腐熟指标的影响最为显著(图5b)。这一结果支持了木质素和纤维素的降解促进hs形成的观点, 木质素和纤维素的深度降解促进了hs结构的复杂性, 使hs结构更加稳定。

图5 木质纤维素含量与木质纤维素降解酶活性之间的相关性(a)及堆肥腐熟程度和理化参数之间的冗余分析(b)fig.5 correlation between lignocellulose content and lignocellulose-degrading enzymes activities (a), and redundancy analysis between compost maturity indexes and compost physicochemical parameters (b)

结合之前的描述, 在稻壳和鸡粪堆肥的降温期接种黄孢原毛平革菌显著提高了lip和mnp的活性, 促进了木质素和纤维素的降解, 表明在稻壳和鸡粪堆肥的降温期接种黄孢原毛平革菌通过提高木质纤维素降解酶(lip、mnp)的活性, 促进了木质素和纤维素的降解, 从而强化堆肥腐殖化。

本研究在鸡粪和稻壳堆肥的不同阶段接种黄孢原毛平革菌, 以探究其对堆肥腐殖化进程的影响。3个处理的温度变化表明在不同阶段进行的微生物接种增强了堆肥中的生物活性, 说明外源添加黄孢原毛平革菌促进了有机化合物降解和增加微生物活性。同时在降温期接种微生物后, 温度明显二次升高, 与chen等报道的结果相似, 表明降温期接种可以延长堆肥的嗜热阶段, 促进有机物的再次降解。

就酶活性而言, t2处理在降温期接种黄孢原毛平革菌后, lip和mnp的活性均显著提高(p＜0.05),这些结果与chen等、zeng等的研究结果一致。此外, t2处理木质素和纤维素含量较t1和t3相比显著降低(p＜0.05); 从有机物料累积降解率来看, t2处理较t1和t3处理显著增加76.41%和48.89%(p＜0.05)。这些结果可能与t2处理中酶活性的变化有关, 因为在堆肥降温期接种黄孢原毛平革菌避免了高温, 菌种生长良好, 产生了更高的酶活性, 促进了对木质素和纤维素等难降解物质的降解, 与zeng等的研究结果相似。

t2处理腐殖质、胡敏酸和富里酸含量也显著高于t1和t3处理。原因可能是在以稻壳为主要原料的木质素废弃物堆肥过程中, 黄孢原毛平革菌在降温期接种, 由于适宜的温度有效保持其活性的同时,增强微生物繁殖代谢能力, 分泌了大量关键降解酶(图2), 促进了纤维素和木质素的深度降解(图3), 大量的微生物利用难降解的纤维素和木质素等物质作为碳源, 纤维素和木质素被降解产生酚类、醌类等hs的重要前体物质使腐殖质结构更加复杂和稳定,加快堆肥腐熟的同时强化了腐殖化进程, 并提高了堆肥产物品质。这些结果表明, 在堆肥降温期外源接种黄孢原毛平革菌可以通过提高木质纤维素降解酶活性, 促进木质纤维素降解, 强化堆肥的腐殖化过程。

研究结果表明, 降温期接种黄孢原毛平革菌有利于木质素降解酶lip、mnp活性提高, 促进木质素和纤维素的深度降解和堆肥的腐殖化程度。 堆肥结束时, 与不接种的堆肥相比, 降温期接种黄孢原毛平革菌的堆肥木质素和纤维素含量降低了78.57%和52.63%, 与堆肥第0天接种相比, 木质素和纤维素含量降低了57.14%和40.00%; 腐殖质含量分别比不接种和堆肥第0天接种高67.84%和52.33%。在堆肥降温期外源接种黄孢原毛平革菌通过提高木质纤维素降解酶活性, 促进木质纤维素降解, 有利于堆肥的熟化和质量提高。