高志颖, 李彦生, 于镇华**, 金 剑, 王光华, 刘晓冰**

(1.东北农业大学资源与环境学院 哈尔滨 150030; 2.中国科学院东北地理与农业生态研究所黑土区农业生态重点实验室 哈尔滨 150081)

大气co浓度已从工业革命前的280 mol?l上升到现今的410 mol?l, 达到过去数百万年以来的最高值, 模型预测大气co浓度将在2050年和2100年分别达到550 mol?l和700 mol?l。土壤微生物是地球上最重要的物质分解者, 是驱动地球元素化学循环的“引擎”, 参与土壤有机质形成和转化, 其群落结构和功能的改变很可能会影响土壤有机质的动态变化。由于土壤中的co浓度远高于大气中的co浓度, 因此大气co浓度的升高对土壤微生物的影响是以植物作为媒介而产生的间接影响。一般情况下, 大气co浓度升高会增强植物地上部分的光合作用, 促进植物地上部生物量的增加, 增加根际沉积物和凋落物等植物来源的碳向土壤中的输送, 这部分碳作为土壤微生物的主要碳源和能源,能够增加微生物的代谢活性。

大豆(glycine max)是世界上最重要的豆科作物之一, 我国东北地区是大豆的主产区, 其大豆产量占据全国大豆总产量的一半以上。自1923年培育出第一个品种以来, 截至20世纪末, 东北地区共培育出600余个大豆品种, 种质资源丰富。且作为c3作物的代表, 大豆对大气co浓度升高的响应比其他非豆科c3作物和c4作物更要敏感。在全球范围内,针对大豆产量、生长状况、生理过程、营养品质和微生物群落结构多样性等对大气co浓度升高的响应开展了广泛研究: 如有研究发现, 大气co浓度升高有利于提高作物产量; 增加大豆成熟期从土壤表面吸收的总氮量; 并且在一定程度上可显著增加大豆r8期脂肪含量, 而显著降低大豆籽粒中蛋白质和游离氨基酸含量; 在营养元素方面, 锌(zn)和铁(fe)浓度在高co条件下也呈降低趋势; 大气co浓度升高也简化了土壤真菌的网络结构及关键菌属等。然而, 大豆根际微生物代谢功能多样性对大气co浓度升高如何响应尚不太清楚, 相关研究将对明确未来大气co浓度升高条件下土壤微生物的代谢过程、解析土壤微生物所参与的土壤养分循环过程和维持土壤碳库的平衡, 维护土壤生态系统生产力和生态功能的稳定性具有重要意义。

据此, 本研究选取东北地区不同年代广泛推广的大豆品种, 利用开顶式气室(open top chamber,otc)模拟21世纪中叶大气co浓度(550 mol?l)升高条件, 通过biolog方法, 解析大气co浓度升高条件下大豆根际土壤微生物对不同碳源利用情况的影响, 以明确未来大气co浓度升高条件下土壤微生物代谢功能的变化, 为进一步揭示未来大气co浓度升高对农田生态系统碳循环的影响提供理论参考。

1.1.1 研究区域概况

试验地点位于中国科学院东北地理与农业生态研究所(45°73′n, 126°61′e, 海拔128 m)。以正常大气co浓度410 mol?l为对照(ck), 利用开顶式气候箱(otc)模拟大气co浓度升高(550±30 mol?l)条件(ec), 每个处理设有3个重复。otc箱体为正八边形结构, 直径3.5 m, 主体高2 m, 体积约为25 m,箱体主体框架由透明亚克力板(透光率＞95%)与三角铁构成, 顶端45°收缩口可减少外部气体对箱内气体的扰动。利用空气搅匀系统及外接的co钢瓶开关来控制保持箱内co均匀分布, 通过大气co浓度监测系统(ci-301, cid, inc.usa)实时监测otc内的co浓度。

1.1.2 供试土壤、大豆材料和生长管理

本试验选取在东北黑土区不同年代广泛种植的4个大豆品种: ‘小黄金’(1951年培育, 简称xh)、‘牡丰5号’(1972年培育, 简称mf)、‘绥农14号’(1996年培育, 简称sn)和‘东生1号’(2003年培育, 简称ds)。试验土壤采集于黑龙江省五常市农田, 将土壤自然风干后过4 mm筛, 装入pvc桶(底面直径29.0 cm, 高25.5 cm), 具体施肥量参照文献[14]。每个pvc桶内播种6粒种子, 每个品种播种12桶, 待出苗后10 d, 每个桶内保留2株长势相近的幼苗, 每个品种选取6桶在正常大气co浓度下生长, 6桶在高co浓度下生长, 分别随机置于3个重复内进行统一管理, 即每个otc中每个品种有2桶。在大豆生长期控制土壤含水量为田间持水量的80%左右。

1.1.3 土壤样品采集方法

采样前将采样必需的容器及工具进行灭菌。在大豆生长最旺盛的r5期(鼓粒初期), 每个otc内, 每个品种选取长势较好的大豆植株1桶。首先,剪掉地上植株, 将盆栽桶倒扣于灭菌报纸上, 然后将桶缓慢拔起, 用手掌轻微敲打土柱使其破碎, 使用 “抖根法”采集根际土, 将收集到的根际土放入封口袋密封置于冰盒内, 尽快运回实验室于4 ℃冰箱保存。每个品种的ck和ec处理的土壤分别有3个重复样品。采用烘干法测定土壤含水量。

1.1.4 土壤微生物群落代谢特征测定

本研究利用含有31种碳源的eco生态板(biolog-eco)分析微生物代谢特征。eco板的接种液制备过程如下: 首先, 根据已测的土壤含水量计算5 g干土所需的鲜土重。然后, 称取相当于5 g干土重的鲜土于45 ml灭菌nacl溶液(0.85%)中, 摇床振荡40 min (170 rpm); 振荡结束后, 取3 ml悬浊液加入到27 ml灭菌nacl溶液(0.85%), 摇床振荡20 min(170 rpm); 之后再吸取悬浊液3 ml加入到27 ml灭菌nacl溶液(0.85%), 振荡10 min。经过上述3次振荡后, 土壤悬浊液最终被稀释1000倍, 吸取150 μl该悬浊液加入到eco板每个小孔中, 将接种好的eco生态板放在保湿的容器中, 于25 ℃的恒温培养箱中避光培养。每隔24 h用biolog仪(biotek instruments inc, usa)读取波长为590 nm下的吸光值。

1.1.5 数据分析

单孔平均颜色变化率(awcd)可反映样本中吸光度特征。常通过绘制每个样品的 awcd值随时间的变化曲线来体现微生物平均活性的变化, 反映微生物碳源代谢的平均状况。其计算公式如下:

式中: c为每个碳源孔的吸光度值, r为对照孔吸光度值。

多样性指数的计算包括shannon指数、simpon指数和invsimpson指数, 计算公式参照文献[18]。采用r软件vegan包进行主成分分析, 主成分响应曲线分析(prc)参照王强等的方法。绘图应用rstudio (version 1.2.5033)软件。

图1a和1b分别为不同大豆品种根际微生物在正常co浓度和高co浓度下的awcd变化趋势。从中可以看出品种sn在正常co浓度下整个培养期内具有较高的awcd值, 而品种mf则在高co条件下整个培养时期内具有较高的awcd值。表明不同大豆品种根际微生物对不同碳源的代谢受大气co升高的影响。因此, 选取培养时间为96 h的awcd值进一步对不同大豆品种在不同co浓度下的微生物代谢功能多样性进行深入分析。

图1 正常co2浓度(a)和co2浓度升高(b)条件下不同大豆品种根际微生物在biolog-eco板上的平均颜色变化率(awcd)fig.1 awcd of microbe in rhizosphere of different soybean cultivars under ambient co2 (a) and elevated co2 (b)concentrations

不同大豆品种根际土壤微生物在不同大气co浓度条件下培养96 h的shannon指数、simpson指数和invsimpson指数如图2所示。从图中可以看出品种xh、mf和ds上述3个指数在大气co浓度升高条件下略有增加但均没有显著差异。但品种sn在大气co浓度升高条件下, 上述3个指数均显著低于正常大气co浓度条件下的指数。

图2 不同大豆品种根际土壤微生物在大气co2浓度升高(ec)及不升高(ck)处理下的微生物多样性指数fig.2 diversity indexes of microbe in rhizosphere of different soybean cultivars under elevated co2 (ec) and ambient co2 (ck)concentrations

双标图(biplot)可将不同土壤样品信息和具体碳源类型相结合, 如图3所示, 相连的为3次重复, 红色箭头表征不同碳源吸光度的变化梯度, 体现了不同样本在碳源吸光度(a2-h4)变化梯度上的分布。对不同大豆品种根际微生物在正常co浓度(ck)下以及高co浓度(ec)下的土壤微生物群落功能多样性进行主成分分析(pca), 结果表明, 前两个主成分pc1和pc2分别解释了原变量特征的35.12%和11.67%。从图3可以看出, 大气co浓度升高条件下, 品种xh、mf和ds的微生物群落代谢功能相似性较高; 而品种sn在ck和ec的样本分别位于主成分1轴的负向和正向两端, 说明不同co浓度导致sn的根际微生物群落对碳源的利用方向发生改变, 其代谢特征受co浓度升高影响较大。第1主成分、第2主成分和第3主成分是变异的主要来源, 相关碳源在3个主成分上的载荷值, 即相关系数,如 表1所示。其中, 对于品种sn的ck处理, 其碳源变化与主成分1中负相关的碳源种类相关性较强,其中负相关的碳源中载荷绝对值大于0.7的有6种,包括氨基酸类1种(l-丝氨酸)、糖类2种(β-甲基-d-葡萄糖苷和d-甘露醇)、羧酸类1种(d-半乳糖醛酸)、聚合物类1种(吐温80)和其他类1种(d,l-α-磷酸甘油); 品种sn的ec处理碳源变化与主成分1中正相关的碳源种类相关性较强, 具体包括糖类的α-d-乳糖和羧酸类的α-丁酮酸(表1)。

表1 31种碳源在大气co2浓度升高(ec)及不升高(ck)处理下在第1、2和3主成分上的载荷值table 1 carbon substrates loaded on the principal components in analysis of biolog eco micro-plate data under elevated (ec)and ambient co2 (ck) conditions

图3 不同大豆品种根际微生物功能多样性在大气co2浓度升高(ec)及不升高(ck)处理下的主成分分析fig.3 principal component analysis of microbe in rhizosphere of different soybean cultivars under elevated co2 ec) and ambient co2 (ck) concentrations

从表2可以看出, 不同大豆品种显著影响了氨基酸类碳源中的甘氨酰-l-谷氨酸(f4)、l-精氨酸(a4)、l-丝氨酸(d4), 羧酸类中的d-半乳糖醛酸(b3)、d-葡糖胺酸(f2), 聚合物类碳源中的吐温80 (d1), 其他类碳源中的1-磷酸葡萄糖(g2)和丙酮酸甲酯(b1);大气co浓度升高显著影响了氨基酸类碳源中的l-丝氨酸(d4), 糖类碳源中的β-甲基-d-葡萄糖苷(a2),羧酸中的d-半乳糖酸γ-内酯(a3)和衣康酸(f3); 大豆品种和大气co浓度交互作用显著影响了胺类碳源中的腐胺(h4), 氨基酸类碳源中的l-精氨酸(a4)、l-天门冬酰胺(b4)、l-丝氨酸(d4), 羧酸类碳源中的γ-羟丁酸(e3)、d-葡糖胺酸(f2)、衣康酸(f3), 聚合物类碳源中的吐温40 (c1)。具体体现在: l-精氨酸、l-丝氨酸、d-半乳糖酸γ-内酯在品种xh中表现为下降, 在其余品种中表现为升高; 1-磷酸葡萄糖在sn中增加, 而在其他品种中降低; 甘氨酰-l-谷氨酸、d-半乳糖酸γ-内酯、衣康酸在mf中降低, 在其余品种中表现为升高; l-丝氨酸、d-半乳糖醛酸、1-磷酸葡萄糖、d-半乳糖酸γ-内酯、腐胺、l-天门冬酰胺在ds中降低, 在其他品种中升高。

表2 大气co2浓度、品种及两者的交互作用对大豆根际土壤微生物不同碳源利用影响的显著性分析table 2 significance analysis of effects of atmospheric co2 concentration, soybean cultivars and their interaction on the utilization of different carbon sources of microbe in rhizosphere of soybean

土壤微生物作为土壤生态系统的重要组成部分,参与土壤养分转化和循环过程, 其代谢活性可以作为评估土壤质量和保持土壤肥力的重要指示因子。本研究中, 不同大豆品种根际土壤微生物利用碳源的动力学特征(awcd)(图1)、主成分分析(图3)以及不同大豆品种对碳源利用情况的显著性分析(表2)表明, 不同大豆品种根际微生物对碳源的代谢功能具有一定差异。金剑等对黑龙江省1950—2006年间推广的大豆品种的主要农艺性状变化进行研究,发现随着品种推广年代由远及近, 新品种在碳同化和分配转运的效率上显著高于老品种。本研究4个大豆品种推广年份不同, 分别是xh (1951年)、mf(1972年)、sn (1996年)和ds (2003年)。因 此,推测本研究不同大豆品种根际微生物代谢特征差异很可能与不同基因型大豆根系分泌物和根际沉积物的组成和数量有关。金剑等对2个不同大豆基因型r1期的根际和非根际微生物群落功能多样性进行了研究, 亦发现不同基因型大豆在碳源利用的类型上不同, 与本研究结果类似。

根际分泌物不仅为根际土壤微生物提供所需的能量, 在一定程度上也支配着根际微生物的生态演替和群落种群模式。因此, 不同的大豆品种可能具有独特的根际微环境和微生物群落结构, 进而具有不同的微生物代谢功能特征。xu等发现不同基因型大豆具有相似的根际细菌群落结构, 但其中可培养细菌群落结构受不同基因型影响显著, 分析原因可能与可培养细菌多为“r-型”生长策略的细菌, 对根系分泌物的变化响应比较敏感。本研究采用biolog方法研究微生物代谢功能多样性, 也是基于针对可培养细菌的研究方法, 进一步佐证了不同大豆品种在根际微生物代谢功能上的差异与品种根系分泌物的差异有关。

co是作物光合作用的底物, 一般来讲, 大气co浓度升高会提高植物的光合作用, 促进植物生长, 故此, 也常将大气co浓度升高对植物的效应归纳为“肥料效应”。相比于c4植物[如玉米(zea mays)], co的肥料效应对c3植物(如大豆)影响更大。高co浓度可通过改变植物的生长、生理代谢过程来影响植物通过根部释放到土壤中的根系分泌物、植物残体的量及其化学组成, 进而间接改变土壤微生物的活性或群落结构。然而, 本研究微生物功能多样性指数结果表明, 大气co浓度升高条件下, 品种xh、mf和ds的微生物群落代谢功能多样性指数变化不显著, pca分析也表明这3个大豆品种微生物群落代谢功能相似性较高, 而品种sn微生物群落代谢功能受大气co浓度升高影响变化显著, 表明不同大豆品种根际微生物对大气co浓度升高的响应不一致。分析原因可能为: 1)高co浓度促进了大豆地上生物量的增加, 致使大豆根系分泌物和根系沉积物也随之增加, 刺激了微生物的生长及活性, 然而随着大豆地上生物量的进一步增加, 大豆与其根际微生物将由于土壤养分的限制形成竞争关系, 微生物可利用的底物缺乏, 导致其代谢功能减弱, 微生物代谢功能最终又回归到与正常co浓度类似的状态; 2)孙雪等研究发现, 土壤理化因子是影响土壤微生物功能多样性的主要因子。我们也证实了本研究中品种xh、mf和ds土壤全碳、全氮、碳氮比和ph在大气co浓度升高时均没有发生显著变化, 这可能是导致上述大豆品种根际微生物功能在大气co浓度升高时没有发生显著变化的原因之一。其中, 土壤ph被广泛报道与细菌群落结构和功能相关性较强。在本研究中, 品种sn的土壤ph受大气co浓度升高影响显著, 其代谢功能亦显著受到大气co浓度升高的影响。

另外, 本研究还发现, 品种sn的ck处理和ec处理分别与主成分1负相关和正相关的碳源代谢能力相关性较强(图3), 其中负相关碳源中的l-精氨酸常见于患病植物根系分泌物中, 2-羟基苯甲酸属于杉木(cunninghamia lanceolata)的主要自毒物质, 二者均不利于大豆生长, 在本研究中l-精氨酸既受到大豆品种的显著影响, 又受到大豆品种与大气co浓度升高交互作用的影响(表2)。已有研究表明, 大气co浓度升高可能会引起植物对环境胁迫的响应发生变化(如干旱、高温和盐渍化等)。由此我们推测, 大气co浓度升高是否也可能通过改变有害根系分泌物的分泌量进而影响大豆对不良环境的耐受能力呢? 由于本研究的碳源类型并不能完全代表大豆生长过程中的实际根系分泌物类型, 这种推断有待通过田间原位试验进一步验证。