杨晓艺 王聪 鹿锦浩 吕绍芝 林海东 裴玉贺

摘要：为了研究myb转录因子的功能及其对逆境胁迫的响应，本研究对玉米自交系辽3162三叶期幼苗进行干旱和盐胁迫处理，克隆zmmyb2基因并进行生物信息学分析，探究该基因在胁迫条件下的表达。该基因开放阅读框长1233bp，编码410个氨基酸，具有多个myb转录因子结合位点，为myb转录因子。经生物信息学分析推测zmmyb2蛋白分子量为46.08kda，等电点为6.38，属于亲水性酸性非分泌蛋白，具有2个myb保守结构域，定位在细胞核内，与高粱、南荻的亲缘关系较近。qrt-pcr结果表明，该基因在玉米叶片中的表达量最高，具有组织特异性，且能响应干旱和盐等非生物胁迫。初步判断该基因对玉米的非生物胁迫应答起着重要作用。

关键词：玉米;zmmyb2;基因克隆;胁迫应答;生物信息学分析;基因表达

myb转录因子家族是一类dna结合蛋白，在植物次生生长发育、细胞周期调控和抗逆生理等方面有着重要作用。1987年pazares等从玉米中发现并克隆了植物中第一个参与花青素合成的myb基因zmmyb2c1[1]，此后随着研究的深入，越来越多的该家族成员被挖掘出来。myb转录因子家族成员具有相似的结构，完整的myb蛋白由三部分组成：myb结构域、转录激活结构域和负调控结构域。myb结构域位于myb蛋白的n-末端，含有约52个氨基酸残基[2]。myb蛋白通常包含1～4个保守的myb结构域，根据myb结构域的数量分为4类———1r-myb、2rmyb、3r-myb、4r-myb[3]。其中2r-myb中的r2r3-myb蛋白是高等植物所独有的，由在n端高度保守的myb域和在c端高度可变的c端域组成[4]，具有多种功能，是目前研究最广泛的myb蛋白，仅在被子植物基因组中就有超过100个成员[5]。

尽管myb蛋白显示出高度的结构相似性，但来自不同物种或生物体的相似蛋白之间却存在明显的功能差异。例如，在烟草中过表达bpmyb4可以诱导一些木质素生物合成基因的表达，导致次生壁增厚[6]。在拟南芥中过表达atmyb75基因也会导致木质素积累的轻微增加，参与木质素生物合成的调控;atmyb3r1和atmyb3r4基因可以激活knolle基因的表达，从而在核分裂中起到积极的调节作用;atmyb88和atmyb124基因可以控制细胞周期和细胞分化过程;atmyb24、atmyb57、atmyb80等基因对花药和花粉粒的发育起重要作用[7]。rgmyb10基因能促进合成毛蕊花糖苷[8]，zmmyb48能调控植物对干旱胁迫的防御[9]，zmmyb268在植物抵御高温方面起重要作用[10]。

本研究以玉米自交系辽3162幼苗为试材，对zmmyb2基因进行克隆并进行生物信息学分析，通过模拟盐胁迫和干旱胁迫，研究其在非生物胁迫下的表达情况，旨在为玉米抗逆育种提供基因资源，为探究myb转录因子调控非生物胁迫的分子机制奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

取玉米自交系辽3162种植在青岛农业大学培养室内，培养条件为（25±2）℃、16h光照/8h黑暗、相对湿度70%，培养至三叶一心时进行盐和干旱胁迫处理，分别用250mmol/l的nacl溶液和20%的peg-6000溶液浇灌幼苗，分别在处理0、6、12、24、48h采集玉米幼嫩的根、茎、叶，于-80℃冰箱内保存备用。

1.2rna提取及cdna合成

使用takaraminibestplantrnaextractionkit（takara公司），从三叶期幼苗组织中提取rna。用超微量分光光度计（nanodrop2000，美国）对提取的总rna浓度和纯度进行检测，同时用1%琼脂糖凝胶电泳进一步检测rna质量。采用hi Ⅱqrtsupermixforqpcr（+gdnawiper）试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）进行cdna第一链的合成。

1.3zmmyb2基因的克隆

用primerpremier5.0软件设计引物。以反转录产生的cdna为模板，利用高保真酶进行pcr扩增，对pcr产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳后切胶回收;将目的条带与克隆载体pmd19-t进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，lb培养基复苏后筛选出多个阳性克隆，选择单菌落进行pcr扩增，选择扩增出目标条带的细菌溶液，送样测序。

1.4zmmyb2的生物信息学分析

通过ncbi搜索获得基因基本信息，然后利用在线分析工具expasy、netphos3.1、signalp4.1、sopma、tmhmm、plantcare等[11-15]对zmmyb2蛋白的理化性质、磷酸位点、保守结构域、亚细胞定位、进化关系、二三级结构、启动子顺式作用元件等进行预测分析。

1.5荧光定量pcr

通过检索获得的zmmyb2基因序列，设计cdna快速扩增的上、下游引物（表1）。使用试剂盒chamqtmuniversalsybrqpcrmastermix（南京诺唯赞生物科技有限公司）在荧光定量pcr仪（quantstudio3，美國abi）上进行荧光定量pcr扩增。采用2-ΔΔct方法[16]计算zmmyb2基因在幼嫩根、茎、叶中的相对表达量及处理0、6、12、24、48h的相对表达量。使用microsoftexcel2010处理数据并进行差异显著性分析和作图。

2结果与分析

2.1zmmyb2基因的克隆及鉴定

根据基因序列设计全长编码区引物，以cdna为模板对zmmyb2进行pcr扩增，从玉米自交系辽3162中扩增出一条长度为1233bp的基因序列，用琼脂糖凝胶电泳对rna和目的基因序列进行验证（图1），根据orffinder可知该基因编码410个氨基酸（图2）。

2.2zmmyb2的启动子序列顺式作用元件预测分析

从ncbi数据库获得zmmyb2基因的启动子前3000bp序列，使用在线软件plantcare对启动子序列的顺式作用元件进行预测，结果（表2）发现，在zmmyb2基因上游不仅有caat-box、tata-box等常见的核心启动子元件，还发现了13个myb转录因子结合位点，表明zmmyb2具有启动子驱动的功能，可能受玉米myb家族成员的调控。

2.3zmmyb2蛋白的理化性质分析

利用在线软件expasy对zmmyb2蛋白进行理化性质分析，结果（表3）显示，zmmyb2蛋白分子式为c2003h3157n589o636s13，由20种常见氨基酸组成，含量最高的为亮氨酸（leu），占总含量的9.8%，谷氨酸（glu）和丝氨酸（ser）次之，占总含量的8.5%，色氨酸（trp）含量最低，仅占0.5%;理论等电点为6.38，小于7，表明zmmyb2蛋白是一个弱酸性蛋白;亲水指数为-0.714，推测为亲水性蛋白。利用在线工具protscale分析得到玉米zmmyb2蛋白的亲/疏水信号图（图3），其多肽链n端和c端皆表现为亲水性，中间部位多数也表现为亲水性，亲水峰值在-0.5以下的信号明显多于峰值在0.5以上的信号，进一步证明了zmmyb2蛋白具有亲水性。

2.4zmmyb2蛋白的磷酸位点、信号肽、结构域预测及亚细胞定位

通过在线软件netphos3.1分析可知，zmmyb2蛋白可能存在46种磷酸化位点（图4），分別为28个丝氨酸（ser）位点、12个苏氨酸（thr）位点和6个酪氨酸（tyr）位点，可以与磷酸基团结合，传递磷酸基团。利用在线软件signalp4.1和tmhmm对zmmyb2蛋白进行信号肽和跨膜结构域预测，结果显示zmmyb2基因编码的蛋白中不存在信号肽和跨膜结构域，从而推测zmmyb2蛋白为非分泌蛋白，是在细胞内起作用的蛋白。根据在线工具cdsearch，查找zmmyb2基因的保守结构域，结果（图5）表明，zmmyb2蛋白含有myb-shaqkyf和myb-cc-lheqle两个myb域，推测zmmyb2蛋白属于myb家族的转录因子。利用在线工具plant-mploc对zmmyb2蛋白进行亚细胞定位，结果表明zmmyb2蛋白定位在细胞核中的可能性最大，推断zmmyb2蛋白最有可能在细胞核中起作用，是能够与dna特定片段结合调控下游基因表达的转录因子。

2.5zmmyb2蛋白的二三级结构预测

利用在线工具sopma分析得知，zmmyb蛋白的多肽链中多以无规则卷曲为主，含量为55.85%，其次为34.88%的α-螺旋，延伸链和β-折叠含量较少，各占7.07%和2.20%。利用在线工具swiss-model对zmmyb2蛋白的410个氨基酸进行3d建模，模板覆盖率为62.07%，得到zmmyb2蛋白的三级结构（图6）。

2.6zmmyb2蛋白的序列对比和进化分析

利用在线工具dnaman6.0，以zmmyb2基因序列为探针，按照最大似然法，将zmmyb2蛋白序列与高粱（sorghumbicolor）、南荻（miscanthuslutarioriparius）、柳枝稷（panicumvirgatum）、黍（panicumhallii）、粟（setariaitalica）、福尼奥小米（digitariaexilis）、野生二粒小麦（triticumdicoccoides）、籼稻（oryzasativasubsp.indica）、大麦（hordeumvulgare）等植物的myb序列进行对比，结果（图7）显示myb蛋白序列的重叠性较高，表明myb转录因子具有较高的同源性，在进化过程中具有一定的保守性。采用dnaman6.0进行多序列比对，利用mega-x构建各植物蛋白的系统发育进化树（图8），发现zmmyb2蛋白序列与高粱和南荻的myb序列亲缘关系最近，同属高粱族，而与籼稻、野生二粒小麦和乌拉尔图小麦（triticumurartu）的亲缘关系最远。

2.7zmmyb2基因的表达分析

qrt-pcr分析zmmyb2基因在不同组织中的表达，结果（图9）显示，zmmyb2基因在玉米根、茎、叶中均有表达，但不同部位的表达量存在差异，根中的表达量最低，叶中最高，为根的3.88倍，茎中的表达量仅次于叶，为根的3.15倍，说明zmmyb2基因的表达具有组织特异性。zmmyb2基因在盐胁迫和干旱胁迫0～48h的表达水平变化情况如图10所示，可见，zmmyb2基因的表达量在nacl胁迫后呈现先降低后升高、处理48h后又显著下降的变化趋势;在模拟干旱处理下呈现升-降-升-降的波动趋势，在处理的12h后显著升高，24h时达到最高。推测zmmyb2基因能够响应nacl和peg胁迫。

3讨论与结论

本研究从玉米中克隆出zmmyb2基因，生物信息学分析结果表明该蛋白为弱酸性亲水性非分泌蛋白，定位在细胞核内;上游序列中含有多个启动子顺式作用元件，具有多个转录因子结合位点，包括myb转录因子结合位点;含有mybshaqkyf和myb-cc-lheqle两个保守结构域。说明zmmyb2属于myb转录因子家族。

本研究发现，zmmyb2基因主要在玉米叶片中表达，其次为茎中，在根中的表达量较低。与前人研究结果类似，如澳洲坚果mimyb2基因主要在枝叶中表达，在花中的表达量较低[17];地黄rgmyb10基因主要在须根中表达，在块根中的表达量较低[8]。chen等利用拟南芥非生物胁迫反应myb蛋白序列，通过比较基因组学，从玉米中鉴定到46个可能参与非生物胁迫的myb基因，其中，转zmmyb30基因能够提高拟南芥对盐胁迫的耐受性，并能增加非生物胁迫相关基因的表达数目[18];胡育峰等研究发现在胚乳中过表达myb14能够提高玉米籽粒淀粉含量[19];tamyb3r1、tamyb1和tamybsdu1基因也在小麦干旱反应中起着重要作用，tamyb2a、tamyb3r1、tapimp1等基因通过抑制植物蛋白磷酸酶2c的表达来提高小麦耐盐性[20];tamybsm3基因通过提高p5cs1、dreb2a、rd29a等非生物胁迫应答基因的表达水平来增强小麦抗旱性[21]。本研究发现，盐胁迫和干旱胁迫均能使zmmyb2基因表达量上调。综合上述分析，可推断myb家族基因的表达具有组织特异性，并对植物抵御非生物胁迫起着重要的调控作用。

本研究结果可为进一步研究zmmyb2基因的生物学功能以及玉米对非生物胁迫应答的分子机制奠定基础。