刘 广， 黄晓云， 徐锦华， 张 曼， 姚协丰， 娄丽娜， 徐 建， 侯 茜， 朱凌丽， 羊杏平

(1.江苏省农业科学院蔬菜研究所/江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，江苏南京 210014；2.苏州农业职业技术学院环境工程学院，江苏苏州 215008)

西瓜枯萎病，别称萎蔫病、死藤病、枯苗病，是由于西瓜的特异专化型病菌尖孢镰刀菌(f. sp.)入侵根部感染而引起的可发生在西瓜植株整个生长期的病害，尤其是在西瓜膨大期更易发生，表现为早期植株出现类似失水的症状，叶子有点萎蔫，慢慢地整株枯死。枯萎病对西瓜产量的影响很大，会导致减产甚至绝收，给农民带来极大的经济损失。因此西瓜不能在同一地块连作。但是由于土地资源的贫乏及温室、大棚等保护地设施的大面积应用，枯萎病发生日益严重，而针对枯萎病选育抗性强的西瓜新品种是解决这一难题最环保有效的措施之一。

一般采用枯萎病接种及田间检测的方法来鉴定西瓜品种的抗性，耗时长且需要大量的人力、物力。分子标记是一种可以连续遗传且在后代中能检测到的dna序列，可以反映植株个体之间或群体之间基因组差异的特异性dna片段，已成功应用于作物的抗性辅助选择、指纹图谱构建、纯度检测等方面。本研究利用西瓜遗传群体筛选与西瓜枯萎病抗性基因紧密连锁的分子标记，并将筛选得到的分子标记应用于西瓜材料的枯萎病抗性选择，从而得到抗性好的西瓜材料，用于后期的育种工作，这对于西瓜的抗性育种具有重要作用。

用1个杂交后代的抗感单株群体以及20个西瓜材料作为本次的试验材料。伊选作为母本，高感枯萎病生理小种1；sugarlee作为父本，高抗枯萎病生理小种1，2017年春季杂交后获得f，2017年秋季进行自交后，获得49个单株f群体，2018年春季进一步自交后，获得f家系。20个西瓜材料及来源见表1。试验材料种植于江苏省农业科学院六合试验基地塑料大棚中。

表1 西瓜材料及来源

1.2.1 苗期人工接种枯萎病病菌的抗性鉴定 利用尖孢镰刀菌西瓜专门型生理小种1对西瓜幼苗进行人工接种鉴定。参照吉加兵的方法进行接种。当西瓜幼苗培养到2叶1心时，取叶片用于dna提取，然后用配制好的孢子悬浮液(孢子浓度为5×10个/ml)进行根部接种。接种后保持环境温度为18～26 ℃。约1周后开始发病，间隔2 d调查发病率以及病情指数。随机提取病样，分离病原物并进行培养，用显微镜观察病原。症状的分类基于martyn的标准，高感(hs)病株率为81%～100%，感病(s)病株率为61%～80%，中抗(mr)病株率为41%～60%，抗病(r)病株率为21%～40%，高抗(hr)病株率为0～20%。其中感病型包括s和hs，病株率在61%及以上；抗病型包括hr、r、mr，病株率在60%及以下。感病对照(sugar baby)、中抗对照(charleston gray)、高抗对照(calhoun gray)来自美国，均由笔者所在实验室繁育。

1.2.2 基因组dna的提取 当西瓜品种生长到2叶1心时，取幼嫩西瓜叶片1.5～3.5 g，利用液氮快速磨成粉末，加入十六烷基三甲基溴化铵(ctab)裂解液，65 ℃水浴0.5～1.0 h，冷却后加入同等体积的三氯甲烷与异戊醇的混合物(体积比为 24 ∶1)，轻轻摇晃25 min左右，在 12 000 r/min 条件下离心10 min，取上清液，抽提1～2次，然后加入10%醋酸钠和预冷的异丙醇，在4 ℃冰箱中静置3 h以上，收集的絮状dna用70%乙醇进行洗涤，干燥后溶解于te缓冲液中，4 ℃保存备用。

1.2.3 引物合成 参考国内外与西瓜枯萎病抗性相关的文献，合成22个/对引物，其中2对切割扩增多态性序列(caps)引物，6对插入/缺失(indel)引物，5对序列特征扩增区(scar)引物，2对衍生切割扩增多态性序列(dcaps)引物，7个随机扩增多态性dna(rapd)引物(表2)。

表2 22个与西瓜枯萎病抗性基因相关的引物

1.2.4 pcr扩增与产物检测 随机扩增多态性dna聚合酶链式反应(rapd-pcr)的体系为 25 μl，其中引物2 μl，dna 2 μl，ddho 8 μl，mix buffer 13 μl。pcr扩增程序为 94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，37 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，40个循环；72 ℃ 10 min。扩增样品在1.0%的琼脂糖凝胶中(加入10% goldview)进行检测。indel/scar/caps/dcaps-pcr反应体系为25 μl，其中包含dna 1 μl，上游引物1.25 μl，下游引物 1.25 μl，ddho 8.5 μl，mix buffer 13 μl。pcr扩增过程为94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共36个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。caps/dcaps产物的酶切反应体系为15 μl：10×buffer 1.5 μl，限制内切酶Ⅰ(来源于thermo fisher scientific公司)0.5 μl， pcr产物5 μl， ddho 8.0 μl。65 ℃保持12 h，80 ℃保持20 h进行酶切反应，反应产物于4 ℃保存。扩增样品采用8.0%聚丙烯酰胺凝胶电泳，在120 v恒压条件下电泳 1～2 h，银染染色。

1.2.5 数据分析 通过joinmap 4.0软件进行枯萎病抗性性状连锁的遗传分析。

表3 西瓜群体对枯萎病生理小种1的抗性鉴定结果

根据伊选×sugarlee f群体苗期枯萎病生理小种1的抗病性检测结果，从f单株中取检测结果表型为抗病性及表型为感病性的单株各5个， 利用它们的基因组dna进行混合构建抗、感基因池。利用集团混合分析(bsa)法对 22个caps、dcaps、indel、rapd、scar分子标记进行多态性筛选，发现3个与西瓜抗性基因紧密连锁的分子标记(indel04、indel05、indel06)。分子标记indel04产生了1个210 bp与西瓜枯萎病抗性基因相连锁的特异标记indel04210；分子标记indel05产生了1个225 bp与西瓜枯萎病抗性基因相连锁的特异标记indel05225；分子标记indel06产生了1个365 bp与西瓜枯萎病抗性基因相连锁的特异标记indel06365(图1)。

然后利用 joinmap 4.0 软件对f代群体的单株进行研究，通过对 49个f代分离群体单株的抗感表型和分子基因型进行分析，发现indel04、indel05、indel06这 3个分子标记位于的一侧，连锁距离分别为 7.5、10.7、13.7 cm(图2)。

利用筛选得到的与西瓜枯萎病抗性基因紧密连锁的indel04、indel05、indel06等3个分子标记对20份西瓜材料进行分子检测(图3)。这20份西瓜材料的抗性性状已经通过苗期接种鉴定确定其西瓜枯萎病抗感性，共有9个抗枯萎病的品种和11个感枯萎病的品种。试验结果显示，indel04、indel05、indel06与苗期接种鉴定结果的符合率分别为85%、90%、90%(图3，表4)。说明indel04、indel05、indel06这3个分子标记可以应用于西瓜材料针对枯萎病生理小种1的抗性鉴定，对西瓜的抗性育种具有重要作用。

表4 20个西瓜材料接种鉴定与分子鉴定结果

枯萎病是西瓜栽培中的一种灾难性土传真菌病害， 严重影响了西瓜的产量和品质。 选育抗枯萎病的西瓜新品种是解决这一生产难题的有效措施。传统的抗性品种筛选耗时费力，开发利用与西瓜枯萎病抗性基因相连锁的分子标记进行辅助选择，可有效提升育种时效，推进抗性育种的进程，对我国重茬严重的保护地栽培具有重要意义。

为了攻克这一难题，国内外科研人员在西瓜抗枯萎病分子标记的辅助育种中做了大量工作，获得了一些与西瓜枯萎病抗性性状紧密连锁的分子标记，但是由于遗传群体不同，标记类型不同，有的标记重复性不佳，不能应用于西瓜品种的抗性育种辅助选择。本研究以父本sugarlee、母本伊选、f代、f代及f代为试验材料，研究了父本sugarlee对西瓜枯萎病的抗性遗传规律，并在前人研究的基础上，利用已发表的22个/对引物对遗传群体亲本及抗感池进行了分析， 筛选得到3个与西瓜枯萎病抗性基因紧密连锁的分子标记(indel04、indel05、indel06)，并利用这3个标记对20份西瓜材料进行了分子检测，与苗期枯萎病抗性鉴定结果基本一致，可应用于之后的西瓜抗性育种辅助选择，对推进西瓜的抗性育种进程及西瓜产业的优质高效发展具有重要意义。