杨海峰， 甘晓雪， 薄高峰， 王佳琪， 郝 璞， 张富满， 王文功， 韩傲霜

(内蒙古农业大学林学院，内蒙古呼和浩特 010018)

分枝角度是形成理想株型的重要组成部分，对植物的生物量、经济林木的产量、固碳量、景观效果均具有重要影响。分枝角度的大小受基因、内源激素以及外界环境等多种因素调控，其中，基因调控是重要的内部因素。研究发现，基因家族对分枝角度的调控尤为显著，隶属于基因家族的基因，最早由takahashi等发现并确认其与分枝角度具有相关性，经kishimoto等研究确定水稻中的基因位于11号染色体近着丝点位置，在pd56和m265之间的68 kb区域中。随着对基因的进一步深入研究，多位科学家先后从水稻()、高粱()、小麦()、玉米()、拟南芥()等植物中发现了基因的同源基因，从而证明了基因并不是单子叶植物所特有的。2017年，xu 等以窄冠白杨为材料，分析了1基因在不同组织部位的表达情况，发现1基因在茎中最多，腋芽、叶中次之，根中表达量最少，这与overbeek对玉米突变体的研究结果相一致，由此证明基因主要参与了植株地上部分的负向地性重力反应。

crispr/cas9技术通过小向导rna(sgrna)介导和cas9 蛋白切割实现对靶基因的编辑(碱基插入、删除、替换等)，从而实现基因敲除。因其具有简便、高效、低价等优点，被广泛应用于水稻、小麦、拟南芥、烟草()、毛白杨()等植物的研究中；其中，在水稻、小麦、拟南芥中都获得了稳定的基因编辑突变体，为植物基因功能研究和遗传改良做出杰出贡献。但目前为止，大部分研究仅是对特定位点的突变，在目标基因上精准编辑的效率很低。近年来，有多位科学家在玉米、大豆[(linn.) merr.]、水稻、拟南芥中尝试了同源基因的精准编辑。例如，svitashev等成功通过基因枪转化法对米未成熟胚中的、等基因进行精准编辑。zhao 等利用双元rna向导的 crispr/cas9 系统对基因的一个特定区段进行了定点替换。因此，开发出高效、精准的crispr/cas9基因编辑技术将是现代基因组学靶向修饰工作的巨大进步，且具有广阔的应用前景。

本研究以银腺杨84k为研究材料，从中克隆获得、、基因的基因组部分序列，设计靶点，构建基因编辑载体，转化84k杨，获得转基因株系，以期为分析基因功能提供研究材料，奠定研究基础，为深入研究crispr/cas9系统在木本植物中的应用和技术改良提供线索，为杨树分子育种及品种改良奠定基础。

银腺杨84k(×84k)无菌苗，由内蒙古农业大学林木遗传育种教研室保存；pen-chimera入门载体和pde-cas9-nptⅡ表达载体质粒由美国农业部林务局西南太平洋工作站林木遗传所赠送；大肠杆菌dh5α感受态细胞和农杆菌gv3101感受态细胞，由笔者所在实验室制备。

使用bioedit软件，以银腺杨84k的全基因组dna数据库创建本地数据库，以沙柳、、基因的蛋白质编码区(cds)序列分别作为查询序列，进行本地blast搜寻，获得3个同源基因序列，分别命名为、、。根据这3个同源基因的序列设计上下游引物，预期产物长度分别为1 836、2 074、1 374 bp。试验用到的引物序列详见表1。

表1 本研究所用引物

采用十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法提取野生84k杨基因组dna为模板，利用-f和-r、-f和-r、-f和-r分别为引物，进行pcr扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收后与pmd 19-t载体连接并测序获得84k杨中、、基因在2条同源染色体上的序列。

利用银腺杨84k基因组数据库及克隆获得的完整序列信息，将、、基因的第1个外显子序列分别在基因编辑靶点在线设计网站(https：//zlab.bio/guide-design-resources)上设计、筛选出得分最高的靶点序列，将靶点正向序列5′端添加attg碱基，靶点的反向互补序列5′端添加aaac碱基，送至中美泰和生物技术(北京)有限公司合成引物。

对pen-chimera入门载体质粒进行酶切，回收酶切产物，获得线性化pen-chimera入门载体。采用重组pcr的方法将添加接头的2条靶点序列进行双链互补，并与线性化pen-chimera载体连接，转化dh5α大肠杆菌，测序鉴定。将构建成功的入门载体pen-chimera和表达载体pde-cas9-nptⅡ进行同源置换，转化dh5α大肠杆菌，对菌落进行pcr鉴定，并测序检测。将成功构建的表达载体转化农杆菌gv3101菌株。

活化携带有表达载体的农杆菌菌株，振荡培养至吸光度为0.6～0.8时，重悬菌液，用于侵染。取培养3～4周无菌苗中上部叶片，垂直叶脉划伤，置于重悬液中，50 r/min振荡侵染15 min。将叶片置于共培养基上，暗培养3 d。转移至分化培养基上光照培养，2～3周继代1次。待叶片长出愈伤组织并分化出芽，芽高2～3 cm时，切下置于生根培养基中培养2～3周即可生根，同时利用生根培养基进行单株增殖扩繁。对获得的抗性株系分别提取dna，以ss61引物和靶点反向序列为引物进行pcr扩增，用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，筛选阳性植株。

以转基因株系dna为模板，加入引物-f和-r进行pcr序列扩增，获得目标产物经切胶回收后与pmd 19-t载体连接，转化dh5α大肠杆菌，对菌落进行pcr鉴定，并测序检测。利用dnaman(version 7.0)对测序结果与靶点序列进行比对，分析编辑效率。

利用银腺杨84k的基因组数据库结合沙柳、、基因的cds序列，经比对获得3个基因的同源序列，分别命名为、、。以野生型84k杨的dna为模板，-f和-r、-f和-r、-f和-r 分别为上下游引物，克隆获得、、基因组部分同源序列，该序列为包含上述基因前2个外显子完整序列的基因组序列。

将上述3个基因的第1个外显子序列分别在基因编辑靶点在线设计网站(https：//zlab.bio/guide-design-resources)上提交设计；获得3个高分靶点序列(图1)。该靶点序列在目标基因上无单核苷酸多态性(snp)位点，gc含量为40%，前间隔序列邻近基序(pam)标识位点为ngg(n可以是a、t、g、c中的任意碱基)，与杨树中同源关系较近的基因同源序列比对结果显示，错配碱基数为3～4个，说明该靶位点特异性较高，符合敲除靶点的设计要求。

将互补双链的靶点序列连接线性化的pen-chimera入门载体，经pcr鉴定，目标条带与预计的369 bp目标片段长度一致(图2-a)。测序结果表明，、、靶点序列成功进入 pen-chimera 入门载体，可进行下一步表达载体构建。

将携带有基因靶点序列的pen-chimera入门载体与pde-cas9-nptⅡ表达载体进行同源置换，pcr鉴定结果表明，目标条带与预计的 933 bp 目标片段长度一致(图2-b)。测序分析结果表明，靶点序列及其驱动元件已成功置换进 pde-cas9-nptⅡ 表达载体中，可用于银腺杨84k的基因转化。

将构建的3个基因编辑表达载体(：：、：：、：：)，通过农杆菌介导法转化84k杨，分别获得21、17、12株抗性株系(图3)。为检测单基因编辑的转化效率，本研究对转化：：载体的21株抗性植株进行pcr鉴定，检测结果表明，共13个株系为阳性植株，pcr阳性鉴定阳性率为61.9%(图4)。

对的13个转基因株系进行靶点序列测序分析，结果表明，在1号、5号、9号株系中均发生不同程度的碱基缺失，其中1号株系靶点的第16、17个碱基发生缺失，5号株系靶点的第15个碱基发生缺失，9号株系靶点的第18个碱基发生插入，靶点编辑效率为23.07%，均为杂合突变体(表2)。

表2 paglazy1a基因编辑株系的靶标位点序列分析

植物分枝角度和分枝方向在植物形态建成过程中具有重要作用，与植物生物量和作物产量密切相关。其中，有关分枝角度调控的分子层面研究目前仍以高粱、水稻、小麦等草本模式植物为主，在木本植物中的研究相对较少，尚缺乏系统性研究。本研究利用crispr/cas9系统对银腺杨84k分枝角度相关基因基因进行敲除，获得抗性植株，检测靶标位点，分析编辑效率，旨在为后续基因家族在杨树中的基因功能研究提供基础参考数据。

crispr/cas系统是近年来发展起来的能够实现对基因组精准定点编辑的技术，相对于其他基因编辑技术效率更显著，操作更便捷，但在某些植物中编辑效率较低。本研究按照sgrna的设计原则，设计基因靶标序列，长度均为20 nt，转化银腺杨84k后对阳性植株进行靶标序列检测，发现靶点编辑效率仅为23.07%，效率较低，可能存在2个方面的原因。首先，靶标序列的长度对编辑效率有影响。据fu等的研究显示，采用小于20 nt的短sgrna进行基因打靶试验，可以有效降低脱靶风险，提高编辑效率。chen等比较不同长度(18、19、20个碱基) sgrna的切割效率，发现长度为 19 个碱基的sgrna具有最高的切割效率。其次，选用合适的启动子能够有效提升crispr/cas9系统的基因编辑效率。本研究利用来自拟南芥的atu6-26启动子构建表达载体，虽然成功获得基因编辑成功株系，表明该启动子可应用于银腺杨84k的crispr/cas9系统研究，但编辑效率较低，可能有启动子的影响。因此，在后续基因编辑工作中，将采用19 nt靶点序列，同时采用来自84k杨的启动子来构建基因编辑载体，预计能够有效提高基因编辑效率。

本研究利用银腺杨84k为材料，成功构建了3个同源基因的基因编辑表达载体，获得13株转化：：载体的阳性株系，其中3个株系基因编辑成功，编辑效率为23.07%。该研究结果可以为基因功能的研究和杨树分子育种提供理论依据，为crispr/cas9系统在银腺杨84k中的应用做了初步探索，同时，为改良crispr/cas9系统提供了参考。