徐 清，戴 明，刘文菁，欧阳立群，林 钦，王 征

（福建省产品质量检验研究院，福建 福州 350002）

茶叶作为全球三大重要加工饮品之一，历来是我国重要的经济作物和出口创汇产品。我国茶叶的消费总量也列居世界之最。然而，近几年来茶叶质量安全事件的屡次频发，不仅严重影响了茶产业的健康发展，还使我国茶业遭受巨大的经济损失。现阶段我国面临的茶叶污染主要是空气、土壤、水体、加工过程中产生，茶叶中环境污染物，特别是持久性有机污染物（persistent organic pollutants，pops），已经成为茶叶质量安全关注的焦点之一。pops是指一类具有耐降解性、蓄积性、高毒性、迁移性等特性的有机污染物。在过去的几十年里，由于人类活动的影响，pops持续存在于环境中，通过食物链生物积累，并产生生物放大效应，不断影响人体的发育、神经系统、生殖系统、免疫系统。pops已成为全球高度优先考虑的危害环境和人类健康的问题之一。

常见的pops主要包括多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，pahs）、多氯联苯（polychlorinated biphenyls，pcbs）、邻苯二甲酸酯（phthalate esters，paes）、有机氯农药（organochlorine pesticides，ocps）四大类。其中，pahs是由煤、石油、木材、烟草等各种天然有机物在空气中不完全燃烧所产生形成的，包括萘、蒽、菲、芘等具有致畸、致癌、致突变的多环芳香族碳氢化合物。pcbs是一类人工合成的氯代芳烃类混合物，在工业上广泛用作热载体、绝缘油及润滑油。pcbs结构十分稳定、半衰期长，具有生物毒性，已被国际癌症中心纳入为致癌物质。paes是一种国内外广泛使用的增塑剂，它是由邻苯二甲酸与特定的酯反应产生、具有软化作用的结构类似的pops。paes与塑料基质之间以非共价键的形式结合，极易溢出，可通过多种暴露途径进入人体。流行病学研究发现paes是一种明确的“儿童持久过敏症”的环境诱导剂。paes还会干扰人体内分泌，造成人体免疫力下降、儿童性早熟、损伤遗传基因、引起心血管疾病等。ocps广泛应用于农作物中，以防治各种有害植物的寄生病、虫害。ocp主要有六六六（hexachlorocyclohexane，hch）和滴滴涕（dichlorodiphenyltrichloroethane，ddt）等品种，这一类型农药属于神经毒物，挥发性小、慢性毒性大，使用之后比较难消失。ocps会干扰人体激素系统，从而损害人类生殖和免疫系统，并可能导致生殖疾病，如乳腺癌和前列腺癌。虽然一些ocps的生产和应用在发达国家已经被禁止了几十年，我国在2002年也已明令禁用。但由于ocps的高持久性和半挥发性特性，使它们仍然广泛存在于水、土壤、沉积物、大气、鱼类和食品中。在茶叶的检测中经常出现ocps超标，严重影响茶叶经济的发展。

目前，对茶叶中持久性污染物分析的很多方法虽然能够同时检测几十种以上污染物，但方法普遍只关注一两类具有密切物理化学性质的污染物，能同时分析大量多类型污染物的方法甚少。本方法拟采用气相色谱-串联质谱（gas chromatography-tandem mass spectrometry，gc-ms/ms）法建立同时测定茶叶中多种pops的方法，对于完善国内相关方面的检测方法、加强茶叶中多种pops的监测无疑具有重要的价值，并为建立其相应的检测方法标准奠定基础。同时为新环境下探寻茶叶中pops关键控制点提供思路，对我国茶产业质量安全具有十分重要的意义。

福建绿茶 华祥苑茶业股份有限公司；湖南黑茶中茶湖南安化第一茶厂有限公司长沙芙蓉中路分公司。

16 种pahs标准溶液：萘（naphthalene，nap）、苊烯（acenaphthylene，acpy）、苊（acenaphthene，acp）、芴（fluorene，flu）、菲（phenanthrene，phe）、蒽（anthracene，ant）、荧蒽（fluoranthene，flt）、芘（pyrene，pyr）、苯并()蒽（benzo()anthracene，baa）、?（chrysene，chr）、苯并()荧蒽（benzo()fluoranthene，bbfl）、苯并()荧蒽（benzo()fluoranthene，bkfl）、苯并()芘（benzo()pyrene，bap）、茚(1,2,3-)芘（indeno(1,2,3-)pyrene，inp）、二苯并(,)蒽（dibenzo(,)anthracene，dba）、苯并(,,)苝（benzo(,,)perylene，bghip），质量浓度均为100 μg/ml 美国accustandard 公司；19 种paes标准溶液：邻苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate，dmp）、邻苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate，dep）、邻苯二甲酸二异丙酯（diisopropyl phthalate，diprp）、邻苯二甲酸二烯丙酯（diallyl phthalate，dap）、邻苯二甲酸二丙酯（dipropyl phthalate，dprp）、邻苯二甲酸二异丁酯（diisobutyl phthalate，dibp）、邻苯二甲酸二丁酯（dibuthyl phthalate，dbp）、邻苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯（bis(2-methoxyethyl) phthalate，dmep）、邻苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯（bis(4-methyl-2-pentyl)phthalate，bmpp）、邻苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯（bis(2-ethoxyethyl)phthalate，deep）、邻苯二甲酸二戊酯（dipentyl phthalate，dpp）、邻苯二甲酸二己酯（dihexyl phthalate，dnhp）、邻苯二甲酸丁基芐基酯（butylbenzyl phthalate，bbp）、邻苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯（bis(2-butoxyethyl) phthalate，dbep）、邻苯二甲酸二环己酯（dicyclohexyl phthalate，dchp）、邻苯二甲酸二庚酯（diheptyl phthalate，dhp）、邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯（bis(2-ethylhexyl)phthalate，dehp）、邻苯二甲酸二苯酯（phenyl phthalate，dphp）、邻苯二甲酸二正辛酯（di--octyl phthalate，dnop）（质量浓度均为100 μg/ml） 美国accustandard公司；18 种pcbs标准溶液：2,2,4′-三氯联苯（2,4,4′-trichlorobiphenyl，pcb-28）、2,2′,5,5′-四氯联苯（2,2′,5,5′-tetrachlorobiphenyl，pcb-52）、3,3′,4,4′-四氯联苯（3,3′,4,4′-tetrachlorobiphenyl，pcb-77）、3,4,4′,5-四氯联苯（3,4,4′,5-tetrachlorobiphenyl，pcb-81）、2,2′,4,5,5′-五氯联苯（2,2′,4,4′,5-pentachloro biphenyl，pcb-101）、2,3,3′,4,4′-五氯联苯（2,3,3′,4,4′-pentachlorobiphenyl，pcb-105）、2,3,4,4′,5-五氯联苯（2,3,4,4′,5-pentachlorobiphenyl，pcb-114）、2,3′,4,4′,5-五氯联苯（2,3′,4,4′,5-pentachlorobiphenyl，pcb-118）、2′,3,4,4′,5-五氯联苯（2′,3,4,4′,5-pentachlorobiphenyl，pcb-123）、3,3′,4,4′,5-五氯联苯（3,3′,4,4′,5-pent achlorobiphenyl，pcb-126）、2,2′,3,4,4′,5′-六氯联苯（2,2′,3,4,4′,5′-hexachlorobiphenyl，pcb-138）、2,2′,4,4′,5,5′-六氯联苯（2,2′,4,4′,5,5′-hexachlorobiphenyl，pcb-153）、2,3,3′,4,4′,5-六氯联苯（2,3,3′,4,4′,5-hexachlorobiphenyl，pcb-156）、2,3,3′,4,4′,5′-六氯联苯（2,3,3′,4,4′,5′-hexachlorobiphenyl，pcb-157）、2,3′,4,4′,5,5′-六氯联苯（2,3′,4,4′,5,5′-hexachlorobiphenyl，pcb-167）、3,3′,4,4′,5,5′-六氯联苯（3,3′,4,4′,5,5′-hexachlorobiphenyl，pcb-169）、2,2′,3,4,4′,5,5′-七氯联苯（2,2′,3,4,4′,5,5′-heptachlorobiphenyl，pcb-180）、2,3,3′,4,4′,5,5′-七氯联苯（2,3,3′,4,4′,5,5′-heptachlorobiphenyl，pcb-189）（质量浓度均为100 μg/ml） 美国accustandard公司；15 种ocps标准溶液：-hch、六氯苯（hexachlorobenzene，hcb）、-hch、-hch、-hch、七氯（heptachlor，hepta）、艾氏剂（aldrin）、外环氧七氯（heptachlorexo-epoxide，isomer b）、内环氧七氯（heptachlor-endo-epoxide，isomer a）、反式氯丹（chlordane，-chlordane）、顺式氯丹（-chlordane，-chlordane）、,′-滴滴伊（2,2-bis(4-chlorophenyl)-1,1-dichloroethylene，,′-dde）、,′-滴滴滴（2,2-bis(4-chlorophenyl)-1,1-dichloroethane，,′-ddd）、,′-滴滴滴（2,4-dichlorodiphenyldichloroethane，,′-ddd）、,′-滴滴涕（4,4′-dichlorodiphenyltrichloroethane，,′-ddt）（质量浓度均为100 μg/ml） 美国accustandard公司。

无水硫酸镁（分析纯）、二氯甲烷（分析纯，经旋转蒸发仪重蒸馏制得） 太仓沪试试剂有限公司；-丙基乙二胺（primary secondary amine，psa，粒度4 μm） 日本gl sciences有限公司；多壁碳纳米管（multi-wall carbon nanotubes，mwcnts，粒径5 nm）天津博纳艾杰尔科技有限公司；正己烷（分析纯，经旋转蒸发仪重蒸馏制得） 天津市科密欧化学试剂有限公司；mips/spe（cnwbond 1 g/10 ml） 德国cnw公司。

bsa 124s分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；sigmr 4-16ks高速冷冻离心机 美国sigma公司；ikams 3 basic单发涡旋振荡器 上海沪粤明科学仪器有限公司；re-5203旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；dtc-27超声波清洗机 鼎泰（湖北）生化科技设备制造有限公司；40 khz、7000d气相色谱-三重四极杆串联质谱仪 美国安捷伦公司；ase-350加速溶剂萃取（accelerated solvent extractor，ase）仪 美国thermo公司。

1.3.1 标准溶液配制

分别准确移取pahs、opcs、pcbs、paes混合标准品各1.00、1.00、0.20、0.40 ml于10 ml容量瓶中，用正己烷稀释，定容至10 ml，充分摇匀，配制成68 种pops标准中间液，再用逐级稀释的方法，配制标准溶液如下：pahs、opcs质量浓度均为0.005、0.01、0.05、0.25、2.5 μg/ml，pcbs质量浓度为0.001、0.002、0.01、0.05、0.5 μg/ml，paes质量浓度为0.002、0.004、0.02、0.1、1.0 μg/ml，现配现用。

1.3.2 样品前处理

1.3.2.1 样品提取

随机取样500 g粉碎后充分混匀，精准称取2.00 g样品，置于ase的萃取池中，将萃取温度设定为100 ℃，静态萃取时间设定为10 min。萃取溶剂使用正己烷-丙酮（9∶1，/），萃取压力设定为1 500 psi，ase的静态循环次数为3 次。萃取完成后，将萃取液氮吹浓缩至近干，再用正己烷定容到1 ml。

1.3.2.2 提取液净化

采用cnwbond分子印迹柱，依次用5 ml二氯甲烷及5 ml正己烷活化柱子。将待净化液转移进柱子，待液面降至柱床时，用6 ml正己烷淋洗柱子，将全部流出液氮吹浓缩至约2 ml后加入quechers净化包（0.15 g mwcnts、0.15 g psa、0.15 g无水硫酸镁），涡旋均匀，14 000 r/min离心5 min。再用6 ml二氯甲烷洗脱上述分子印迹柱，收集洗脱液与quechers净化后溶液合并混匀，氮吹浓缩至近干，再用正己烷定容到2.0 ml，待上机。

1.3.2.3 空白实验

除不加实验外，均按1.3.2.1、1.3.2.2节测定步骤进行，操作过程中应避免接触塑料制品，待上机。

1.3.3 仪器条件

1.3.3.1 色谱条件

色谱柱：db-5ms毛细管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；载气：氦气（he）；恒压，压力8.001 3 psi；进样口温度250 ℃；升温程序：60 ℃保持1 min，以40 ℃/min升温到170 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min升温到310 ℃并保持5 min；色谱柱流量1.0 ml/min；进样量1.0 μl；进样方式：不分流进样。

1.3.3.2 质谱条件

离子源：电子电离（electron ionization，ei）源；离子源温度280 ℃；电离能量70 ev；碰撞气体：氮气；传输线温度290 ℃；溶剂延迟时间4 min；数据采集模式：多反应监测模式（multiple reaction monitoring，mrm）。68 种pops的质谱信息见表1。

表1 68 种pops的离子对信息、碰撞电压和保留时间table 1 quantitative ions,qualitative ions,collision energy and retention time of 68 pops

续表1

2.1.1 加速溶剂萃取条件的优化

加速溶剂萃取是一种在高温高压的条件下，用溶剂萃取固体或者是半固体样品的前处理方法。由于加速溶剂萃取的提取效率极高，除目标物外部分杂质也会被同时萃取下来，因此，萃取溶剂、萃取温度、静态萃取时间和循环萃取次数等条件均需优化。

2.1.1.1 萃取溶剂的选择

对目标物的溶解性的大小是影响萃取回收率的关键因素，由于pops是一类非极性或弱极性化合物，考虑到“相似相溶”原理，优先选用实验室常用的极性较弱试剂正己烷、甲苯和二氯甲烷进行萃取，研究了提取液对空白样品加标（0.1 mg/kg）萃取平均回收率的影响，结果见图1。结果表明，正己烷对多数目标物的萃取效果最佳，根据文献报道，加入一定量丙酮能够更好地提取pops，因此，考察正己烷-丙酮（9∶1，/）和正己烷-丙酮（1∶1，/）对上述加标样的萃取效果，结果发现萃取效果差异不大，且均优于正己烷直接提取，但正己烷-丙酮（1∶1，/）萃取液中含有大量色素类杂质，颜色较深。因此，本实验选择正己烷-丙酮（9∶1，/）混合液作为ase的萃取溶剂。

图1 萃取溶剂对68 种pops回收率的影响fig.1 effect of extraction solvents on recovery rates of 68 pops

2.1.1.2 萃取温度的选择

由于溶剂的黏度会随着温度的升高逐步下降，从而加强了溶剂浸润茶叶和溶解目标物的能力。升温同时也有助于破坏目标物和基质之间的作用力，增强目标物扩散到溶剂中的能力。但是过高的温度也可能会造成目标物的降解等问题而影响萃取效果，通常ase的适合温度为75～125 ℃。以正己烷-丙酮（9∶1，/）为溶剂，比较不同萃取温度（80、90、100、110、120 ℃）空白茶叶基质中添加回收（各目标物添加量为0.1 mg/kg）实验下pops的回收率，结果见图2。结果表明，当萃取温度为100 ℃和110 ℃时，多数目标物的萃取回收率最高，当萃取温度为80、90 ℃，部分高沸点目标物的回收率较低，萃取温度为120 ℃时，部分低沸点目标物的回收率较低。另外，考虑到在能满足要求的情况下，用尽可能低的萃取温度可以节省能源，故最终设定ase萃取温度为100 ℃。

图2 萃取温度对68 种pops回收率的影响fig.2 effect of extraction temperature on recovery rates of 68 pops

2.1.1.3 静态萃取时间的选择

在ase萃取过程中，热平衡时间、吹扫时间分别与萃取温度、萃取池体积相关，因此，需要优化的萃取时间为静态萃取时间。本实验在固定其他萃取条件下，分别考察5、10、15、20 min 68 种pops萃取回收率的影响，结果见图3。结果表明，静态萃取时间为10 min时，50 种以上pops萃取回收率达到85%以上，增加静态萃取时间，回收率增加不明显，考虑到时间成本和使用效率问题，因此，选择ase的静态萃取时间为10 min。

图3 静态萃取时间对68 种pops回收率的影响fig.3 effect of static extraction time on recovery rates of 68 pops

2.1.1.4 静态循环次数的选择

对于浓度很高或者基质穿透性很差的样品，采用多次静态循环能够有效提高萃取效率。本实验在固定其他萃取条件下，分别考察静态循环1、2、3、4、5 次对66 种pops萃取回收率的影响，结果见图4。结果表明，循环萃取3 次时大部分目标物回收率高于85%。增加循环次数，回收率增加不明显，且溶剂中含有的微量部分paes回收率会达到110%以上，因此，选择ase的静态循环次数为3 次。

图4 静态循环次数对68 种pops回收率的影响fig.4 effect of number of static cycles on recovery rates of 68 pops

2.1.2 净化条件的选择

茶叶ase提取液中共流出的干扰物含量较高，直接进样一方面会污染仪器，另一方面也会因为极强的基质效应造成检验结果不准。其中色素干扰物去除常见的方法是使用mwcnts，但是mwcnts对于pahs这类平面结构的化合物吸附性极强，因此本实验先选用分子印迹柱将pahs从茶叶提取液中保留下来，再使用quechers方法净化固相萃取的流出液，该流出液包含除pahs以外的另外52 种pops，最后将quechers方法净化和分子印迹固相萃取净化液合并后浓缩，并优化了净化条件。

2.1.2.1 分子印迹固相萃取（mips/spe）净化条件

采用文献[29]的净化方法，考察对16 种pahs的净化回收率，结果表明，回收率在78.3%～103.2%之间，净化效果良好。mispe法对目标化合物的特异选择性强，能从茶叶提取液这种复杂基质中将pahs分离，并且具有较强的富集能力，能吸附低浓度的目标化合物。

2.1.2.2 quechers净化条件的优化

常用的吸附剂有c、psa、mwcnts、florisil、gcb等，其中psa能去除样品中的有机酸、茶多酚和儿茶素类物质；c能吸附非极性物质，可去除少量色素、甾醇、脂肪和维生素等；mwcnts、florisil、gcb的添加均可吸附色素类物质，而mwcnts对色素的去除效果最优，因此选择c、psa、mwcnts作为吸附剂。

影响quechers净化效果的参数主要有吸附剂的用量、基质溶剂的种类、基质溶剂的用量、净化时间。因此选取上述几点作为4 个因素，按照1.3.2节的方法处理绿茶样品，考察0.20 mg/kg加标量的净化效果，以68 种目标物的平均回收率为考察指标，用l（3）正交试验表安排试验，见表2。通过正交试验得出这4 个因素对提取效率的影响为＞＞＞，最优合成条件为。

表2 quechers净化正交试验因素与水平table 2 levels of four independent variables used in orthogonal array design for optimization of quechers conditions

2.1.3 提取净化条件的验证

由于未发现含有pcbs的茶叶阳性样品，故选择3 份分别检出6 种pahs、5 种paes和1 种ocps的阳性样品，按照2.1.1、2.1.2节中的方法验证提取和净化条件，发现3 份阳性样品的优化结果和加标样品的优化结果一致，故该前处理方法适用于实际茶叶中pops检测。

2.2.1 色谱柱的选择

由于pops 是一类非极性或弱极性化合物，根据“相似相溶”原理，先选择hp-5 ms 毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）进行分离，结果表明bbfl和bkfl分离不开，重合为一个峰，见图5a，通过调节升温程序，无法改善分离效果，于是再选择db-5ms毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）进行分离，bbfl和bkfl得到了有效分离，峰形尖锐对称，见图5b。由此可见，即使同为5%苯基甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱，不同厂家产品之间还是有所不同。根据实验结果，选择db-5ms毛细管柱用于本研究。

图5 bbfl和bkfl的mrm色谱图fig.5 mrm chromatograms of bbfl and bkfl

2.2.2 质谱条件的选择

在确定各种pops的母离子后，采用子离子扫描方式进行二级质谱分析，分别选取丰度较强的主要碎片离子作为定量子离子，丰度次强的主要碎片离子作为辅助定性子离子。通过优化碰撞能量、离子能量、质谱分辨率等质谱参数，使各种pops的基峰离子与特征碎片离子产生的离子对强度均达到最大。

为优化质谱的参数，需要将68 种目标化合物进行全扫描，全扫描的目的为了选择丰度较高且质量数较大的特征离子作为目标离子的母离子，有助于消除杂质的干扰。选用mrm采集模式，一方面是因为它能够有效提高多种pops的分辨率，降低假阳性的检出率，另一方面其专属性强、灵敏度高、抗干扰能力强，是目前最灵敏的ms模式，尤其适用于多种pops的测定。因此选用mrm为最佳数据采集模式。根据欧盟2002/657/ec指令规定可知，只需要选择两个或两个以上离子对作为确证点，方可准确定性定量。

在选定的色谱条件下，利用gc-ms/ms全扫描方式，对68 种pops基质加标溶液进行分析，得到总离子流色谱图（图6），68 种目标物均得到了良好分离，且具有较高的灵敏度。

图6 0.20 mg/kg基质加标样品提取液的ei-mrm色谱图fig.6 mrm chromatogram of sample spiked with 0.20 mg/kg of standards

对于痕量检测来说，基质效应是定量分析中必须考虑的问题。基质效应评价主要以基质匹配标准曲线斜率和纯溶剂标准曲线斜率比确定。当斜率比＜0.9时，为基质抑制效应；当0.9≤斜率比≤1.1时，基质效应可以忽略；当斜率比＞1.1时，为基质增强效应。以空白绿茶为基质配制标准曲线和纯溶剂标准曲线进行比较，结果见表3，其中32 种目标物表现出一定程度的基质增强效应。因此采用基质匹配标准曲线进行定量，以消除基质效应。

表3 68 种pops的线性回归参数、检出限和基质效应table 3 regression parameters,detection limits,and matrix effects of 68 pops

续表3

选取已知空白绿茶样品，用1.3.2节的前处理方法，得到基质提取液，再使用逐级稀释的方法用其制备与1.3.1节一致的基质标准系列溶液，分别测定，以每种pops的质量浓度为横坐标，定量离子对的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果见表3。68 种pops在各自范围内均呈良好的线性关系，线性相关系数均高于0.99。以3 倍信噪比为检出限，10 倍信噪比为定量限，检出限和定量限如表3所示，68 种pops的检出限（＞3 倍信噪比）与定量限（≥10 倍信噪比）分别在0.11～4.3 μg/kg与0.4～14.3 μg/kg之间。

在优化后的实验条件下，分别在绿茶、黑茶样品中做加标回收实验，添加水平分别为各pops的1、2 倍定量限和10 倍定量限，每个水平做3 个平行，回收率和精密度结果见表4。在3 个不同添加水平下，68 种pops的加标回收率为73.1%～109.5%，相对标准偏差（relative standard deviation，rsd）为0.1%～9.3%，表明方法的准确度和精密度均较好。

表4 绿茶和黑茶在不同加标水平下68 种pops的加标回收率与精密度（n=3）table 4 recoveries and precision rsds of 68 pops in green tea and dark tea at different spiked concentration levels (n=3)

续表4

利用本研究建立的方法对2020—2021年抽检的60 份茶叶样品中的68 种pops进行测定，所有样品均检出pops。其中pcbs均未检出；opcs仅一份样品检出,′-ddt，含量为121.3 μg/kg；pahs仅有2 份样品未检出，含量范围为未检出～323.1 μg/kg，检出率和检出量均较高的项目包括nap、acpy、acp、phe和chr；paes均有检出，含量范围为215.1～16 571.2 μg/kg，检出率和检出量均较高的为dmp、dep、dibp、dbp和dehp。

建立茶叶中68 种pops的gc-ms/ms分析检测方法。通过优化萃取条件，优化分子印迹柱与quechers法净化方式，优化gc-ms/ms全扫描分析等仪器条件，方法学参数验证良好。该方法适应性强，适用于不同茶叶样品中pops的实际检测。方法对于完善国内pops的检测方法、加强茶叶中多种pops的监测具有重要价值，为建立pops相应的检测方法标准奠定基础。