徐蕾蕊，李 丹，汪 琦，马 丹，魏咏新，魏海燕，赵晓娟，张西萌，曾 静

（中国海关科学技术研究中心，北京 100026）

诺如病毒（norovirus，nov）为正向单链rna病毒，分为5 个基因型（gi～gv），大多数感染人类的nov属于gi型和gii型，引起腹泻呕吐等急性症状，严重可致死亡。nov主要通过污染食品进行传播，食品中含有微量nov即可引起感染。因此需要建立科学、高效的食品中nov检测手段，控制nov引起的疾病，保障人民健康。

数字聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，pcr）技术通过将反应体系无限稀释，可使pcr扩增的荧光信号由指数形式转换为数字信号，检测灵敏度提高到单分子水平。目前，微滴式数字pcr平台中的逆转录微滴式聚合酶链式反应（reverse tran ase droplet digital polymerase chain reaction，rt-ddpcr）无需单独进行逆转录反应，直接定量rna，可作为食品中nov定量检测的有效技术手段。

食品中nov定量需要病毒浓缩、核酸提取纯化等前处理过程，但此过程中病毒回收率未知，故rt-ddpcr定量结果不等于食品中nov实际载量。需要建立简便操作性强的过程控制程序，指示nov回收率，换算食品中nov实际载量。ms2噬菌体是一种无包膜+ssrna病毒，大小和结构与nov比较接近，可作为过程控制模式病毒添加到食品样品中。

本研究拟以rt-ddpcr检测体系为基础，建立nov定量检测方法，探索ms2噬菌体的过程控制程序，构建基于rt-ddpcr技术的食品中nov定量检测方法。

牡蛎、苹果、羽叶生菜和草莓 市购。

gi、gii型nov、星状病毒（humanastrovirus，hastv）、甲肝病毒（hepatitis a virus，hav）、轮状病毒（rotavirus，rv）rna，ms2噬菌体悬液（效价7.2×10pfu/ml），本实验室保存；gi型nov rna标准物质（特性值（5.4±1.2）×10拷贝/μl）和gii型nov rna标准物质（特性值（5.9±1.2）×10拷贝/μl），本实验室研制保存；gii型nov阳性粪便样品，由北京儿童医院赠送。

焦碳酸二乙酯（diethyl paracanbonate，depc）处理水、蛋白酶k 天根生化科技（北京）有限公司；总rna提取试剂trizol、super iii platinum one-step quantitative rt-pcr system 美国英杰生命技术有限公司；无水乙醇、异丙醇、氯仿 国药集团化学试剂北京有限公司；qiaamp virial rna mini kit 德国qiagen公司；dynadbeads mrna purification kit 美国life technology公司；one-step rt-ddpcr advanced kit for probes 美国伯乐公司。

热循环仪、实时荧光pcr仪 美国应用生物系统公司；qx-200数字pcr系统、微滴生成仪 美国伯乐公司；微定量核酸蛋白分析仪 美国赛默飞世尔科技公司。

1.2.1 引物探针设计和筛选

根据nov基因型分型保守区域：编码rna依赖的rna聚合酶（rna dependent rna polymerase，rdrp）区域和开放阅读框2（open reading 2，orf2）编码主要结构蛋白vp1区域，通过ncbi在线工具进行序列分析和比对，利用prime express软件v4.0（abi,foster city,ca,usa）分别设计gi型和gii型nov引物和探针；对于ms2噬菌体，选取dreier等设计的引物和探针，通过ncbi在线工具blast进行序列分析和比对，确定目的片段同源性。分别取实验室保存的gi、gii型nov rna和提取的ms2噬菌体rna为模板，首先采用荧光pcr方法对设计的引物探针进行筛选和特异性验证，再采用rt-ddpcr体系进一步验证筛选的引物探针的特异性。反应参数：荧光pcr：50 ℃反转录15 min，95 ℃热启动2 min，95 ℃变性15 s、60 ℃退火延伸1 min、40 个循环；rt-ddpcr：参照one-step rt-ddpcr advanced kit for probes试剂盒说明书配制反应体系，60 ℃反转录60 min，95 ℃热启动10 min，95 ℃变性30 s、60 ℃退火延伸1 min、40 个循环，98 ℃酶失活10 min，4 ℃保持，升降温速率2～3 ℃/s。

1.2.2 rt-ddpcr体系扩增温度优化

分别以实验室保存的gi、gii型nov rna和提取的ms2噬菌体rna为模板，按one-step rt-ddpcr advanced kit for probes试剂盒说明书，分别在不同退火温度下进行扩增反应，以阳性微滴扩增强度为标准，对筛选出的引物探针退火温度进行优化。

1.2.3 gi、gii型nov和ms2噬菌体rt-ddpcr定量检测方法学评估

1.2.3.1 3 个rt-ddpcr定量检测方法的定量限和准确性分析

ms2噬菌体核酸拷贝浓度测定：取ms2噬菌体悬液100 μl，提取rna后溶于100 μl depc水，应用微定量核酸蛋白分析仪测定其od、od/od及核酸质量浓度值，重复测定5 次，取平均值作为提取的rna核酸质量浓度值。计算提取的ms2噬菌体核酸拷贝浓度，公式如下：

将保存的gi、gii型nov rna标准物质和提取的ms2噬菌体rna分别按多倍梯度稀释，每个梯度各取2 μl，分别进行rt-ddpcr检测，每个梯度重复检测4 次，计算相对标准偏差（relative standard deviation，rsd），分别确定3 个rt-ddpcr定量检测方法的定量限，分析检测值与理论值之间的关系，确定检测体系的准确性。

1.2.3.2 3 个rt-ddpcr定量检测方法的重复性分析

分别取gi、gii型nov rna标准物质和提取的ms2噬菌体rna为模板，按10 倍梯度稀释，各取高、低两个梯度进行相应的rt-ddpcr检测，每个梯度各取2 μl。每种模板分别各取3 个平行进行稀释，每个平行每个梯度重复检测6 次，同时设置1 个空白对照（depc水）。计算各样品各梯度的检测值与其理论值的偏差，分析检测方法的重复性。

1.2.4 实际样品中添加ms2噬菌体对nov定量检测结果的影响分析

由于cen iso/ts 15216-2:2019中不同食品基质的前处理方法不同，选择贝类（牡蛎）、硬质表面食品（苹果）、生食蔬菜（羽叶生菜）以及软质水果（草莓）4 种食品基质用于制备阳性样品。根据cen iso/ts 15216-2:2019中不同食品基质的检测用量，分别向牡蛎消化腺2 g、苹果（带皮）表面100 cm、羽叶生菜25 g和草莓25 g样品中添加100 μl实验室保存的nov阳性粪便样品（gii型nov），静置30 min，每种基质制备两份平行阳性样品。制备的阳性样品（包括牡蛎消化腺2 g、苹果（带皮）表面100 cm、羽叶生菜25 g和草莓25 g）全部用于rt-ddpcr定量检测。各阳性样品参照cen iso/ts 15216-2:2019中不同不同食品基质的前处理方法进行病毒洗脱和浓缩，其中一份阳性样品在前处理过程中添加100 μl ms2噬菌体悬液，另一份平行的阳性样品不添加ms2噬菌体悬液。病毒洗脱和浓缩后，提取rna溶于100 μl depc处理水中。将提取的阳性样本rna分别进行gii型nov和ms2噬菌体rt-ddpcr定量检测，每份样品重复检测6 次，分析添加ms2噬菌体对阳性样品中nov定量检测结果的影响。

1.2.5 基于rt-ddpcr技术的食品中nov定量检测方法的实际应用

从超市或市场购入贝类样品23 份、硬表面食品8 份、生食蔬菜9 份、软质水果15 份，共计55 份样品。硬表面食品和生食蔬菜购入后立即进行检测或保存于4 ℃，贝类和软质水果可立即进行检测，或者保存于-80 ℃。参考cen iso/ts 15216-2:2019中对不同食品基质的检测用量的规定，分别取贝类消化腺2 g、硬表面食品表面积100 cm、生食蔬菜25 g、软质水果25 g，采用基于rt-ddpcr技术的食品中nov定量检测方法进行nov筛查和定量检测，且每份实际样品在检测前，均添加100 μl实验室保存的ms2噬菌体悬液作为过程质控，分析不同食品基质中ms2噬菌体的回收率，并计算阳性样品中nov实际载量。

采用spss 17.0统计软件分析各组之间的差别，统计方法采用检验和单因素方差分析，检验水平=0.05。

根据nov基因型分型保守区域分别设计出3 组gi型nov引物、探针和4 组gii型nov引物、探针，引物探针序列未给出。荧光pcr筛选结果表明，针对gi型和gii型nov的各组引物探针均能有效扩增出靶基因，其中来源于gb 4789.42—2016《食品微生物学检验 诺如病毒检验》的引物探针cog1-f/r/ring1-p和cog2-f/r/ring2-p具有较高的扩增效率，可筛选分别用于构建gi、gii型nov rt-ddpcr体系。对其特异性进行验证（图1）。荧光pcr特异性验证结果表明，筛选的gi型nov特异性cog1-f/cog1-r/ring1-p、gii型nov引物探针cog2-f/cog2-r/ring2-p和ms2噬菌体引物探针ms2-tm3-f/r/p特异性良好（图2），各筛选的引物探针序列见表1。

图1 荧光pcr筛选引物探针fig.1 screening of primers and probes by fluorescence pcr assay

图2 荧光pcr验证引物探针特异性fig.2 specificity of selected primers and probes verified by fluorescence pcr assay

表1 筛选的rt-ddpcr引物探针序列table 1 sequences of selected primers and probes for rt-ddpcr assay

rt-ddpcr特异性验证结果表明，3 个rt-ddpcr体系只有各自对应目的片段特异性扩增，其余病毒经检测均呈阴性，证明筛选的3 组引物探针在rt-ddpcr体系中特异性良好（图3）。

图3 rt-ddpcr检测方法特异性实验结果fig.3 specificity of rt-ddpcr assay

由图4a、b可见，50 ℃条件下gi、gii型nov目的基因片段的扩增效率均偏低，阳性微滴和阴性微滴分界不明显；55 ℃和60 ℃条件下目的基因片段扩增效率较高，可出现比较明显的阳性微滴簇，且55 ℃条件下扩增的荧光信号略高于60 ℃，因此，将55 ℃作为gi和gii型nov rt-ddpcr检测体系的最佳最火温度；由图4c可见，55 ℃条件下ms2噬菌体目的片段的扩增效率偏低，阳性微滴和阴性微滴分界不明显；57.5、60 ℃和62.5 ℃条件下目的基因片段扩增效率较高，阳性微滴和阴性微滴可明显分解，且62.5 ℃条件下扩增的荧光信号略高于57.5 ℃和60 ℃，因此，将62.5 ℃作为最佳退火温度。

图4 rt-ddpcr检测体系在不同退火温度下扩增结果fig.4 amplification efficiencies of rt-ddpcr assay at different annealing temperatures

对于ms2噬菌体rna，5 次重复测量得到的核酸浓度平均值为1.269 μg/ml（测量结果未给出）。ms2噬菌体为单链rna病毒，基因组由3 569 个核苷酸组成，故计算得到的ms2噬菌体rna拷贝浓度为6.29×10拷贝/μl。

将gi、gii型nov rna标准物质和ms2噬菌体rna分别按多倍梯度稀释，直至稀释浓度分别为5.4、5.9 拷贝/μl和6.29 拷贝/μl，每个梯度4 个重复实验，分别进行rt-ddpcr检测。结果表明，gi和gii型nov的rt-ddpcr检测最后两个稀释倍数的rsd均较大，但是均在25%以内，表明这两个检测体系的绝对定量检测灵敏度均可达到5 拷贝/μl；而ms2噬菌体rt-ddpcr检测rsd为4.5%～42.0%，对单个拷贝浓度样品的4 次重复的rsd达到42%，故ms2噬菌体rt-ddpcr检测的绝对定量检测灵敏度可达到10 拷贝/μl梯度（表2）。

表2 rt-ddpcr检测体系的定量限和准确度（n＝4）table 2 limits of quantitation and accuracy of rt-ddpcr assays (n=4)

3 个体系所检测的浓度值与相应的理论浓度值均具有很好的线性关系，并且与理论拷贝数相符，3 个rt-ddpcr检测体系分别能够对gi、gii型nov和ms2噬菌体进行准确定量（图5）。

图5 rt-ddpcr检测体系的线性关系fig.5 linear relationship of rt-ddpcr assays

对于高浓度样品和低浓度样品，3 个rt-ddpcr检测体系的rsd 均小于25%，与理论值的偏差为0.34%～15.63%，单因素方差分析发现，各rt-ddpcr检测体系的3 个重复检测值之间无显著差异（＞0.05），可见rt-ddpcr检测体系的重复性均较好（表3）。进一步分析数据发现，高浓度样品3 个平行样品的测定rsd总体上低于低浓度样品，可见模板的浓度对rt-ddpcr检测体系的重复性影响较大，样品浓度范围在10～10数量级范围内时，rt-ddpcr检测体系能够较好地对目的模板进行定量检测。

表3 rt-ddpcr检测体系的重复性（n＝6）table 3 repeatability of rt-ddpcr assays (n=6)

贝类消化腺（牡蛎消化腺）、硬表面食品（苹果）、生食蔬菜（羽叶生菜）和软质水果（草莓）4 种食品基质中，添加与未添加ms2噬菌体过程控制的平行样品，gii型nov定量检测结果相近，检验结果值均大于0.05，差异无统计学意义（表4）。4 种食品基质过程控制回收率分别均大于1%，均符iso/ts要求。添加了ms2噬菌体的样品可通过将gii型nov定量检测结果除以回收率，得到nov载量，均达到了10拷贝数量级，rsd为2.4%。

表4 不同食品基质中nov样品定量检测结果（n＝6）table 4 results of quantitative detection of norovirus in different food matrixes (n=6)

实际样品检测结果表明（具体数据未给出），在23 份贝类样品中有2 份检出gii型nov rna，检出率为8.70%。硬表面食品、生食蔬菜和软质水果样品中均未检出食源性病毒。不同的食品基质中ms2噬菌体作为过程控制的回收率不同，贝类消化腺中的过程控制回收率在18.2%～78.6%之间，硬表面食品中的过程控制回收率在9.4%～58.2%之间，生食蔬菜中的过程控制回收率在8.5%～32.2%之间，软质水果中的过程控制回收率在1.7%～19.9%之间。

nov是引起急性暴发非细菌性胃肠炎的首要致病原体，美国疾病控制与预防中心监测研究估计30%～50%的食物源性胃肠炎暴发与nov有关。nov通过污染肥料或水体进入食物链，被污染的水体中生长的滤食性贝类，可浓缩水体中的nov，当人类生食来自被nov污染水体中的贝类或者食用未熟透的贝类时，可感染nov；此外携带了nov的食品加工者也可能将病毒颗粒转移到食品上。由此可见，被nov污染的食物是其传播的关键，建立科学、高效的食品中nov检测手段，对控制nov引起的疾病，保障人民健康具有重要意义。

数字pcr技术将pcr体系分割为许多独立的反应单元，模板在独立的反应单元中进行pcr扩增，检测每个反应单元是否有荧光信号判断是否含有扩增模板，通过泊松统计学处理，不依赖标准曲线和循环阈值可直接定量核酸拷贝数。定量检测rna时，需要将rna反转录为cdna。kiselinova等在两步法反转录数字pcr对定量检测hiv rna时，仍然需要依赖标准曲线计算rna的拷贝浓度。rt-ddpcr可避免反转录给定量结果带来的偏倚，目前已有研究成功利用rt-ddpcr实现水体中的rv rna直接定量检测，灵敏度与real-time pcr相当。

本研究以实验室保存的gi、gii型nov rna标准样品为模板，分析构建的nov rt-ddpcr检测体系的检出限包括10～10拷贝/μl 5 个数量级。rt-ddpcr对高浓度模板样本检测能力受限，主要原因是ddpcr平台仅可生成小于20 000 个微滴，当模板浓度达到10拷贝/μl数量级，不能通过泊松分布计算模板含量。但是对于低浓度模板样本，rt-ddpcr具有较小的变异系数和更高的灵敏度，tang hui等结果表明，ddpcr具有更好的可重复性，对低拷贝的质粒标准品的定量检测优于实时荧光pcr。yan yong等发现，dd pcr能够从real-time pcr检测阴性的咽拭子标本中检测出流感病毒载量，其检测灵敏度更高。

基于rt-ddpcr技术的食品中nov定量检测方法，需要构建过程控制程序，采用的模式病毒应具备以下条件：1）可建立rt-ddpcr检测体系，具有与nov相当的准确性、灵敏度和变异性；2）容易培养，无生物危害，能够确定效价；3）与nov基因有明显区别，不影响检测结果；4）在自然状态中不出现，只能人为添加到被检测食品中。ms2噬菌体是一种无包膜+ssrna病毒，侵染宿主为f+（雄株）大肠埃希氏菌，大小和结构与nov比较接近，可通过计数噬菌斑确定其效价，对人体没有致病性，基因组不含nov的靶基因序列。本研究建立了ms2噬菌体rt-ddpcr检测体系，准确性、定量限和重复性与nov rt-ddpcr检测体系相当，且不影响食品中nov的rt-ddpcr定量结果，因此，可作为过程控制的模式病毒被添加到食品中指示回收率，计算食品中nov的实际载量。

采用本研究建立的基于rt-ddpcr技术的食品中nov定量检测方法，对市售的食品样品进行检测，结果仅在贝类样品中检出nov，检出率为8.7%，与cheng等的研究中的检出率相近，而在硬表面食品、生食蔬菜和软质水果样品中均未检出nov。出现以上结果与不同食品基质中nov污染方式不同有关。贝类为滤食性动物，可将被nov污染水体中的病毒颗粒富集到消化腺中。有研究表明，被nov污染的水体中，贝类经过4～5 h的生物富集作用，每个贝类消化腺中可达到＞1 000 nov载量，贝类消化腺中的nov浓度可高于周围水体数十倍至数千倍，而且在净化后的贝类中也常常检出nov。硬质表面食品、生食蔬菜和软质水果没有生物蓄积过程，即使被nov污染，其污染水平可能远达不到贝类消化腺中的nov浓度。

本研究建立了基于rt-ddpcr技术的食品中nov定量检测方法，可定量检测单个拷贝数量级的nov核酸。nov通常富集或吸附于不同食品基质内部或者表面，需要经过病毒洗脱浓缩、核酸提取纯化等前处理，才能对食品中的nov进行定量检测，但是前处理过程往往可导致nov颗粒大量损失，造成rt-ddpcr定量结果与食品中nov实际载量不匹配的现象。由此可见，后续需要针对优化nov洗脱浓缩，改善核酸提取效率，提高nov整体回收率等方面进一步研究，以提升rt-ddpcr检测体系对食品中nov定量检测的准确性。