刘 辉，张会生，童火艳，江晓楠，陈晓婷

（1.广东海天创新技术有限公司，广东 佛山 528000；2.佛山市国创生物发酵食品技术创新中心，广东 佛山 528000）

大豆作为传统发酵调味品中主要原料之一，其蛋白质是大豆生物活性肽的主要来源，是开发功能性调味品的理想原料。大豆蛋白属于一类球蛋白，其主要由2 种球蛋白组成：-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白，约占大豆蛋白的65%～80%。在此基础上，细分球蛋白种类主要为2s、7s、11s、15s球蛋白，11s和7s球蛋白是大豆蛋白中的主要蛋白，约占60%。酶解大豆蛋白产物，是大豆生物活性肽主要来源之一，因其广泛的生物学功能受到科学研究者的密切关注。在大豆蛋白肽的多种活性功能中，抗氧化活性是最主要的功能之一。大豆抗氧化肽能有效清除机体内残存的氧自由基，保持机体内氧自由基的稳定，从而发挥机体抗衰老、抗疲劳、提高免疫力、调节受损皮肤等功效。在自然发酵食品中，以酸性或弱酸性条件为主，在此条件下更有利于酸性蛋白酶和中性蛋白酶的发挥，而碱性蛋白酶由于ph值的不适，很难发挥其主要作用。碱性蛋白酶是一种专一性广泛的内切蛋白酶，尤其倾向于催化裂解蛋白质中不带电荷侧链大的氨基酸（芳香族和脂肪族氨基酸，如异亮氨酸（ile）、亮氨酸（leu）、缬氨酸（val）、甲硫氨酸（met）、苯丙氨酸（phe）、酪氨酸（tyr）、色氨酸（trp））c端肽键，而且当n端为疏水性氨基酸时裂解更快，从而形成以疏水性氨基酸为末端的肽。hu fei等采用碱性蛋白酶水解核桃蛋白获得新型抗氧化肽（氨基酸序列为layqytdfetr）。在抗氧化肽中n端和c端氨基酸对其抗氧化活性有很大影响。例如，n端的疏水氨基酸能够增加肽的抗氧化活性，而c端氨基酸常为trp、谷氨酸（glu）、leu、ile、met、val和tyr可增强肽的抗氧化活性。han ruixian等对比碱性蛋白酶和中性蛋白酶对不同蛋白水解后的功能，发现大豆蛋白是提供生物活性最好的原料。

课题组前期优化了碱性蛋白酶的酶解条件，从大豆蛋白中获得具有最大抗氧化活性的肽。本实验对最优酶解条件下的大豆蛋白抗氧化肽进行研究，采用高效强阴离子交换柱、快速弱阴离子交换柱和制备液相方法，分离纯化抗氧化肽，并使用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，lc-ms/ms）、氨基酸分析仪对抗氧化肽进行鉴定分析。

tris（分析级） 美国西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；三氟乙酸（色谱级）、乙腈（色谱级）、蛋白测定试剂盒 美国赛默飞世尔科技公司；氯化钠（分析级） 天津市耀华化学试剂有限责任公司；抗氧化测定试剂盒 北京索莱宝生物技术有限公司。

akta pure 25m1蛋白质层析纯化系统 美国通用电气公司；1100 series高效液相色谱仪、millspectrum分析软件 安捷伦科技（中国）有限公司；2545制备型液相色谱仪 美国沃特世公司；g6545b lc-ms/ms美国安捷伦科技有限公司；la8080 氨基酸分析仪日立（中国）有限公司。

1.3.1 酶解大豆蛋白抗氧化肽的分离

1.3.1.1 强阴离子交换柱分离抗氧化肽

将超滤（截留分子质量5 kda）后的酶解大豆蛋白抗氧化肽样品（优化酶解工艺得到抗氧化活性最强的样品），冻干浓缩，溶于用1 mol/l naoh溶液调至ph 9.0的水溶液中用于初步分离。

采用hitrap q hp强阴离子交换柱（25 mm×50 mm）分离抗氧化肽，柱平衡缓冲液为50 mmol/l ph 9.0 tris-hcl缓冲液。平衡2 个柱体积后上样，上样量为1 ml。未结合的物质用2 个柱体积的tris-hcl缓冲液冲洗去除。用含0～1.0 mol/l nacl的50 mmol/l ph 9.0 tris-hcl缓冲液进行线性洗脱，洗脱体积为10 个柱体积，洗脱流速为3 ml/min，每管收集2 ml洗脱液。洗脱后用5 个柱体积含1.0 mol/l nacl的tris-hcl缓冲液清洗柱子。在214 nm波长下，测定各管洗脱液的响应信号。将出峰物质收集后冻干浓缩，用于后续测定。

1.3.1.2 弱阴离子交换柱分离抗氧化肽

用1 mol/l naoh溶液将酶解大豆蛋白抗氧化肽样品调至ph 8.0用于初步分离。

采用hitrap deae -ff 阴离子交换柱（25 mm×150 mm）分离抗氧化肽，柱平衡缓冲液为50 mmol/l ph 8.0 tris-hcl缓冲液。平衡2 个柱体积后上样，上样量为1 ml。未结合上的物质用2 个柱体积的tris-hcl缓冲液冲洗去除。用含0～1.0 mol/l nacl的50 mmol/l ph 8.0 tris-hcl缓冲液进行线性洗脱，洗脱体积为10 个柱体积，洗脱流速为3 ml/min，每管收集2 ml洗脱液。洗脱后用5 个柱体积含1.0 mol/l nacl的tris-hcl缓冲液清洗柱子。在214 nm波长下，测定各管洗脱液的响应信号。将出峰物质收集后冻干浓缩，用于后续测定。

1.3.1.3 制备液相分离纯化抗氧化肽

采用zorbax sb-c色谱柱（21.2 mm×250 mm，7 μm）；平衡2 个柱体积后上样，上样量为1 ml；流动相a：超纯水+0.1%三氟乙酸；流动相b：乙腈+0.1%三氟乙酸；洗脱程序：38% a+62% b，洗脱38 min，流速10 ml/min。在214 nm波长下，测定吸光度。将出峰物质收集后冻干浓缩，用于后续测定。

1.3.2 高效液相色谱测定抗氧化肽的纯度

选用poroshell 120 sb-c色谱柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）。流动相a：超纯水+0.1%三氟乙酸；流动相b：乙腈+0.1%三氟乙酸。洗脱程序：35% a+65% b，流速1.0 ml/min，洗脱时间20 min。在214 nm波长下，测定吸光度。

1.3.3 lc-ms/ms测定抗氧化肽分子质量

将纯化后的抗氧肽溶于水中使其质量浓度为0.5 mg/ml。

色谱条件：上样量1 μl；infinitylab poroshell 120 sb-c色谱柱（2.1 mm×150 mm，2.7 μm）；流动相a：超纯水+0.1%三氟乙酸；流动相b：乙腈+0.1%三氟乙酸；等度洗脱：90%～10% a、10%～90% b，洗脱时间10 min，流速0.5 ml/min。

质谱条件：离子源：电喷雾离子源；正离子模式；喷射电压3.0 kv；锥形电压80 v；离子源温度80 ℃；分解温度200 ℃；锥形气体流量10 l/h；气体去溶剂化流速600 l/h；碰撞能量10～50 ev；一级质谱扫描范围/100～3 000；二级质谱扫描范围/100～3 000。

1.3.4 氨基酸分析仪测定抗氧化肽氨基酸组成和数量

用6 mol/l hcl溶液在110 ℃下水解抗氧化肽12 h。水解后，加入naoh溶液进行中和。取20 μl中和后溶液上样，采用pico-tag c色谱柱。通过与氨基酸标准品的对比，确定抗氧化肽氨基酸组成和数量。

1.3.5 lc-ms/ms测定抗氧化肽序列

将抗氧肽溶于水中使其质量浓度为0.5 mg/ml。色谱和质谱条件与1.3.3节一致。

1.3.6 抗氧化肽数据库比对

将抗氧化肽的质谱数据输入到millspectrum软件中，在uniprot数据库，搜索类别为taxonomy，输入大豆种属为glycine max，选择reviewed数据库中共409 个大豆数据，下载并将数据库加载入millspectrum软件中，根据实验条件选择分析模式，确定抗氧化肽的来源和序列。

由于酶解大豆是在碱性条件下，大豆蛋白在酶解过程结束后，其中的酸性肽或中性肽普遍带有负电荷，hitrap q hp强阴离子交换柱能有效吸附带有负电荷的大豆抗氧化肽。

如图1所示，在洗脱体积0～15 ml范围内，nacl浓度并未发生变化，主要目的是洗脱上样后未结合在色谱柱上的物质，提高样品的纯度。将出峰物质收集后通过抗氧化活性检测，结果表明抗氧化肽主要在洗脱体积30～60 ml之间，在此范围内出现多个相互重叠的物质峰，说明hitrap q hp强阴离子交换柱不仅对目标物质有较强的吸附能力而且对于非目标物也存在较强的吸附，主要是色谱柱性质和ph值两个方面作用的结果。jin duxin等采用碱性蛋白酶水解玉米蛋白后，在ph 8.5条件下使用q-sepharose阴离子交换柱进行分离抗氧化肽时，出现大范围的重叠物质峰。此外，在分离鱼类蛋白被水解产生的抗氧化肽和分离果汁蛋白被水解产生的抗氧化肽的研究中，都在初分离时用到阴离子交换柱，并且其目标区都出现大范围重叠区。因此阴离子交换层析分离抗氧化肽只是分离纯化过程中的第一步，得到高纯度的抗氧化肽依然需要借助其他色谱柱同共完成。

图1 hitrap q hp强阴离子交换柱分离抗氧化肽fig.1 separation of soybean protein hydrolysate on hitrap q hp strong anion exchange column

由图2可知，与强阴离子交换柱的结果相似，在洗脱体积0～150 ml范围内，nacl浓度并未发生变化，主要目的是洗脱上样后未结合在色谱柱上的物质，提高样品的纯度。将主要出峰范围收集液通过抗氧化活性检测，结果表明抗氧化肽范围在洗脱体积300～350 ml之间出峰。表明hitrap deae-ff弱阴离子交换柱能有效分离抗氧化肽，而且抗氧化肽出峰的位置在阴离子柱的后端，说明此类抗氧化肽较其他肽类吸附能力更强，能有效将抗氧化肽与其他肽类杂质分离开。ren jian等使用deae弱阴离子交换柱分离葵花籽蛋白水解抗氧化肽；sampath kumar等使用deae弱阴离子交换柱分离鱼类水解抗氧化肽。此外，deae弱阴离子交换柱还可以用于虾酱、鸡肉水解蛋白、大米水解蛋白等抗氧化肽的分离。因此，在抗氧化肽的分离过程中deae弱阴离子交换柱比q hp强阴离子交换柱在分离抗氧肽方面更为普遍，但是分析相关文献的整体纯化过程，发现deae弱阴离子交换柱更多应用于抗氧化肽的初步分离和二次分离，并非最终分离的色谱柱，其主要原因是相同性质的肽类会重叠。如图1所示，抗氧化肽的出峰位置明显存在其他物质，说明其中还存在其他肽类或蛋白物质，需要进一步分离。

图2 hitrap deae-ff弱阴离子交换柱分离抗氧化肽fig.2 purification of antioxidant peptides on hitrap deae-ff weak anion exchange column

制备型液相是通过反相色谱柱，根据物质的极性强弱分离物质的一种有效方法，其主要特点是通过高压能有效提高分离的精密度，其次通过不同反相色谱柱接合性质不同，能有效将比较难分离的物质分开，包括一些旋光异构体。

由图3可知，制备型液相分离出了单一的抗氧化肽。通过对出峰位置抗氧化活性的检测，结果表明在3 个出峰物质浓度相同时，具有抗氧化活性的肽出峰时间为3.27 min，将其命名为shp-1。收集制备液相分离的抗氧化肽物质通过高效液相色谱测定纯度，高纯度的抗氧化肽有利于分子质量和结构的测定。zhang miao等通过制备液相最终从碱性蛋白水解甜土豆蛋白中分离出5 种抗氧化肽，并分析出它们的结构和组成。harnedy等通过制备液相从海藻酶解蛋白中分离出一种新型抗氧化肽（氨基酸序列为sditrpggqm）。大部分抗氧化肽的分子质量都不大于1 000 kda，分子筛在分离纯化过程中的作用不明显。抗氧化肽一般都为单链和二级结构，结构比较稳定，不易受到有机试剂对活性的影响。因此，在分离纯化抗氧化肽过程中，制备液相是必备的方法。

图3 制备液相分离抗氧化肽fig.3 separation of shp-1 by preparative liquid chromatography

分析型高效液相色谱较制备型高效液相，最主要的不同是分析型液相色谱柱的粒径、孔径可以更小，柱效更好，可以有效检测分离样品的纯度。

由图4可知，在保留时间2～4 min出现了两个峰。第1个峰为仪器上样峰，这是由于设备上样时会出现极短时间的流动相切换，导致电导率出现波动，所以出峰形状出现正负峰；第2个峰为样品溶剂峰，主要是由于样品在进入色谱柱后，被流动相稀释，导致部分流动相与样品溶剂混合后打破原有的平衡体系而出现。由图4还可知，在保留时间9.952 min处有明显出峰，说明抗氧化肽shp-1有较高的纯度，根据峰面积计算出shp-1的纯度为96.27%，达到了可用于分析shp-1分子质量、成分组成、排列顺序的纯度；其抗氧化比活力为30 u/μg。保留时间10.447 min处为隐藏峰，经检测为制备液相中与shp-1相邻物质峰（相关的数据并未列出）。在肽类物质的分离纯化中，制备液相与分析型液相的应用十分普遍，可防止相似性质物质的干扰。kim等在研究紫苏种子中蛋白质酶解后产生的抗氧化肽时，制备液相分离纯化的两种抗氧化肽出峰位置与在分析型液相中十分相似。这说明在肽类物质的分离纯化中，制备型液相与分析型液相是相辅相承，通过不同类型的色谱柱，可以有效避免出现相似物质重叠的现象。

图4 抗氧化肽shp-1的高效液相图谱fig.4 hplc profile of shp-1

抗氧化肽分子质量可用于初步判断抗氧肽是否为新型抗氧化肽。通过分析抗氧化肽的分子质量还可初步了解抗氧化肽的氨基酸组成数目，为其结构和成分分析提供理论帮助。

由图5 可知，抗氧化肽shp-1 的分子质量为741.41 da。tang xueyan等研究表明抗氧化肽的抗氧化活性与其分子质量和疏水性存在十分重要的关联。当抗氧化肽分子质量小于1 kda时，更能表现出强抗氧化性，低分子质量抗氧化活性强的特性仅限于某些蛋白水解肽。lin songyi等研究水解蛋清蛋白发现分子质量小于1 kda的抗氧化肽的活性明显高于其他分子质量组。cai luyun等将小分子肽的酶解抗氧化活性与其他282 种肽类的抗氧化活性进行对比，结果表明分子质量与抗氧化活性有着密切的关联。此外，根据氨基酸平均分子质量为128 da，初步确定抗氧化肽shp-1含有5～7 个氨基酸。

图5 抗氧化肽shp-1的ms/ms谱图fig.5 ms/ms spectrum of shp-1

氨基酸组成是抗氧化肽体现自身抗氧化性质的重要方面。由于氨基酸的抗氧化性能，才使得肽类物质具有抗氧化性，而不同的氨基酸抗氧化性能完全不同。

由表1可知，抗氧化肽shp-1主要由5 种氨基酸组成，分别为ile、脯氨酸（pro）、甘氨酸（gly）、val、tyr。对于有环状结构的氨基酸（组氨酸（his）、trp、tyr和pro）能够通过环状结构中的羟基供体提供氢供体，因此可以作为羟自由基清除剂。大部分抗氧化肽都含有疏水氨基酸his、trp、phe、pro、gly、赖氨酸（lys）、ile和val，这些疏水氨基酸能有效帮助酶解后肽分子形成疏水微环境提高肽的抗氧化性。根据shp-1各氨基酸浓度可知氨基酸的数量：gly 1 个、val 1 个、ile 1 个、tyr 1 个、pro 3 个。各氨基酸组成肽链后分子质量为741 da，与质谱分子质量相同，由此证明shp-1是由5 种氨基酸组成。

表1 shp-1氨基酸组成和数量table 1 amino acid composition of shp-1

抗氧化肽的抗氧化活性与氨基酸序列关系密切，通过氨基酸有效组合不仅可以提高抗氧化肽的抗氧化活性，还可以提高其稳定性。因此了解氨基酸序列是研究抗氧化肽的最重要内容。

由图6可知，抗氧化肽shp-1的序列存在两段谱图，一段解析质谱序列为ile-pro-（pro+gly）-val；另一段解析质谱序列为pro-gly-val-pro-try。根据分子质量推测shp-1的序列可能为ile-pro-pro-gly-val-try。抗氧化活性与其氨基酸序列有着明显关联，bamdad和samaranayaka等认为在c端含有tyr和trp都能表现出强自由基清除能力。chen huaming等研究28 种合成肽，表明抗氧化肽在c端去除一个his能明显影响抗氧化肽的活性，而在n端将leu去除对于抗氧化肽的活性并无显著影响。pro是抗氧化肽中重要的一类氨基酸，pro倾向于干扰和改变肽类分子的二级结构，从而增加肽类物质的抗氧化性。丝氨酸（ser）和ile这类氨基酸无论是在n端还是在c端都可以表现出高自由基清除能力。zou tangbin等指出抗氧化肽的抗氧化活性在于c端和n端的氨基酸残基的带电性质、氢键性质和空间位置，其中c端的疏水性和抗氧化肽的带电性质是最重要的。应用各类酶水解特定蛋白，通过各种分离纯化手段寻找功能肽是非常耗时、耗力的方法。由于各类蛋白质的研究，已经清楚了从基因到蛋白的氨基酸序列，通过各类酶解模拟作用氨基酸的位点分析酶解蛋白产生的肽序列，对比生物活性肽库的数据，可以快速分析得到系列的生物活性肽及其蛋白亚基与位置。选择适宜的酶和条件，利用lc-ms/ms精准分析，不仅高效而且还能大幅降低研发成本。

图6 抗氧化肽shp-1氨基酸序列分析ms/ms谱图fig.6 ms/ms spectrum showing amino acid sequence of shp-1

利用蛋白数据库比对，是研究蛋白或肽类物质最快捷、有效的方法，可以为研究人员提供复杂的代谢路径，又可以单一确定某一种类和某一个蛋白。根据质谱结果表明，在n端的数据是由两个氨基酸总和得出。因此，无法判断两个氨基酸的排序，将质谱数据输入millspectrum数据库中进行对比。

由表2可知，shp-1属于大豆球蛋白g4，同属于大豆蛋白11s系列。序列比对结果表明shp-1的序列为ippgvpy，比对后的分子质量和偏差分子质量与实际测定shp-1的分子质量吻合。因此，可以将对比后的序列认定为shp-1的序列。生物活性肽数据库可以帮助研究人员快速确定物质属性，目前开放性的生物数据库有biopep（http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep）、pepbank（http://pepbank.mgh.harv ard.edu/）、feptiddb（http://www4g.biotec.or.th/feptidedb/）和brainpeps（http://brainpeps.ugent.be/）。girgih等研究水解大麻籽蛋白，通过数据库比对最终获得两种抗氧化肽（氨基酸序列分别为wvyy和pslpa）。lassoued等采用肽类组学研究水解鱼胶蛋白，确定20 种抗氧化肽，分子质量为417～1 809 da，氨基酸数量为5～21 个。頡宇等利用biopep数据库模拟不同蛋白酶的酶解工艺，实验确定最佳条件后，获得新型抗氧化肽（氨基酸序列为ldepdpl）。由此看出，未来肽类的研究离不开肽类物质数据库，特别是二肽、三肽等小分子肽的研究中，数据库可以帮助研究人员更快发展新物质和整合物质特性。

表2 shp-1蛋白数据库比对结果table 2 results of comparison of shp-1 to protein data

在前期碱性蛋白酶酶解大豆蛋白的最佳条件下，依次采用hitrap q hp强阴离子交换柱，hitrap deae-ff弱阴离子交换柱以及制备液相方法将获得的抗氧化活性肽分离纯化，最终获得高纯度的抗氧化肽shp-1。通过lc-ms/ms测定抗氧化肽shp-1分子质量为741.41 da。氨基酸分析仪对shp-1抗氧化肽的组成进行分析，抗氧化肽shp-1是由5 种氨基酸组成。lc-ms/ms对抗氧化肽shp-1二级质谱图解谱以及大豆蛋白数据库比对，抗氧化肽shp-1氨基酸序列为ippgvpy。shp-1来自于大豆球蛋白g4亚基。