王 乐，陈泓岑，张永红，吴 琼，侯佳佳，王天祎，卢天航，黄传发，张 华，崔德凤

(北京农学院动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京 102206)

随着畜牧业和饲料工业的发展，饲料添加剂的发展进入了一个新的阶段，中草药饲料添加剂以其能预防动物疾病、提高畜禽产品产量和繁殖性能等优点而日益受到关注，应用前景极为广阔。相对于抗生素而言，中草药具有促进动物生长，提高生产性能，改善动物机体免疫，抗氧化、抗炎、抗菌，减少有害气体排放，降低抗性基因蓄积及转移等作用，可作为抗生素替代产品广泛应用于畜禽健康养殖。不论从健康角度还是从经济效益角度来看，替代抗生素产品的生产和研发显得尤为重要，而中草药以其独有的优势成为众多学者的优先选择。因此，开发安全性高的中药饲料添加剂代替原有的抗生素及化学药物将是大势所趋。

丹参又名赤参、紫丹参、红根等，为唇形科植物丹参的干燥根和根状茎。味苦，微寒，归心、肝经，有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈的功效，用于胸痹心痛，脘腹胁痛，癥瘕积聚，热痹疼痛，心烦不眠，月经不调，痛经经闭，疮疡肿痛。据报道，丹参的化学成分主要分为两大类：脂溶性二萜醌类化合物和水溶性酚酸类成分。其中脂溶性包括丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ a、丹参酮Ⅱ b、二氢丹参酮、隐丹参酮等，具有抗氧化、消炎、抑菌等作用；而水溶性成分包括丹参素、丹酚酸等，具有抑制血小板凝聚、扩张冠状动脉等作用。李晓明等研究表明，在衣霉素(1 mg·kg) 灌胃复制小鼠急性肝损伤模型中，经丹参酮 Ⅱ 处理后，其可通过抑制肝组织grp78/caspase-12 通路活化，降低内质网应激水平，改善衣霉素所致的小鼠急性肝损伤。张东涛等用丹参水提物治疗乳鼠心肌细胞缺氧-复氧损伤，发现丹参水提物对缺氧-复氧损伤的心肌细胞具有保护作用，这可能与 pi3k/akt 信号通路的激活有关。由此可见，丹参对缓解应激具有良好的作用。

然而，目前关于丹参是否对肠道菌群失衡具有调节作用，尚未见报道。因此，本研究以丹参提取物为研究对象，应用网络药理学与高通量测序16s rdna技术研究丹参对小鼠大肠杆菌感染模型的肠道菌群结构的影响，以期阐明丹参提取物调节菌群结构的作用机制，为丹参提取物的临床应用提供理论依据。

在tcmsp 数据库(https://tcmspw.com/tcmsp.php)搜索丹参活性成分，根据tcmcp，口服利用度(oral bioavailability，ob)≥30%、类药性(drug-likeness，dl)≥0.18表示药物成分口服吸收良好并且适合于药物开发，药物对小肠上皮细胞通透性(caco-2)≥0.4表示药物对小肠上皮细胞通透性良好。因此，根据ob≥30%、dl≥ 0.18、caco-2≥0.4这3个参数对丹参活性成分进行初步筛选。同时收集活性成分所对应的蛋白靶点，利用 string 数据库(https://cn.string-db.org)，转换靶点蛋白为对应的基因名称。

在 genecards数 据 库(https://www.genecards.org/) 中输入关键词“”，查询并收集其靶点基因；将已转换成基因名的丹参活性成分作用靶点与靶点基因取交集(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，从而得到丹参治疗感染的潜在作用靶点。

将活性成分与对应潜在作用靶点基因导入 cytoscape 3.8.2软件，构建丹参治疗感染的“活性成分-潜在作用靶点”网络，并应用软件中“network analyzer”功能进行网络拓扑结构分析，可获得活性成分及作用靶点的连接度(degree)、紧密度(closenesss)及介度(betweenness)等网络拓扑参数。选取丹参成分连接度≥平均数为关键活性成分，靶点连接度≥平均值为关键靶点。

利用david 数 据 库(https://david.ncifcrf.gov/)，物种选择“”，对潜在作用靶点进行go功能分析，利用 scape数据库(https:// scape.org/)进行 kegg 通路富集分析，其中go功能分析包括生物学过程(biological process，bp)、分子功能(molecular function，mf)及细胞成分(cellular component，cc)分析。

本试验以安徽地区精品丹参经煎熬回旋蒸发浓缩后获得的丹参提取药液为研究对象，以110只体重为(20±5)g的昆明小鼠作为试验对象，随机分为5组：对照组(con)、大肠杆菌感染组()、饲喂低剂量丹参提取物大肠杆菌感染组(el)、饲喂中剂量丹参提取物大肠杆菌感染组(em)、饲喂高剂量丹参提取物大肠杆菌感染组(eh)，每组22只。参考人推荐用量的1、5、10倍，设丹参提取物的药物浓度分别为0.0195、0.039、0.078 g·ml，分别为本次试验的低、中、高剂量丹参提取物大肠杆菌感染组给药剂量。小鼠体重以20 g计，按390 mg·kg量进行灌胃，即每次每只试验鼠灌胃0.2 ml。每日定时定量灌胃1次，连续28 d，各丹参组灌胃不同浓度药物0.2 ml，对照组与大肠杆菌感染组均灌胃0.2 ml同等剂量的生理盐水。

将检查过菌种纯度的o菌种进行传代复苏。在灭菌的试管当中进行将该菌种的复苏，将冻存菌液加入到5 ml左右的营养肉汤液体培养基，置于摇床上，转速设定成为220 r·min，温度设定成为37 ℃，培养12 h，传三代复苏至镜下观察菌形态良好即可。将菌液用比浊管比浊，将菌液浓度大概培养至 6×10cfu·ml。

本试验的5组小鼠连续灌胃28 d后，将新鲜培养所得的o按半数致死量对灌胃低、中、高剂量丹参组和大肠杆菌感染组进行腹腔注射0.2 ml·只，而对照组腹腔注射0.2 ml·只的无菌生理盐水，观察24 h。

丹参组和大肠杆菌感染组腹腔注射o及对照组注射无菌生理盐水24 h后取小鼠的粪便，进行标记，保存于-80 ℃。使用magpure stool dna kf试剂盒b(magen，中国)，按照制造商的说明书提取粪便样本的微生物群落dna。使用qubit dsdna br assay kit (invitrogen公司，美国)对dna进行定量，并用1%琼脂糖凝胶进行均一检测。使用引物341 f(5′-actcctacgggaggcagcag-3′)和806r (5′-ggactachvgggt-wtctaat-3′)扩增细菌16s rrna基因的可变区v3-v4。正向和反向引物均用illumina接头、pad和接头序列标记。在含有30 ng模板、融合pcr引物和pcr主混合物的50 μl反应中进行pcr富集。pcr循环条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30个循环；最后在72 ℃延伸10 min。pcr产物用ampurexp磁珠纯化，在洗脱缓冲液中洗脱。库通过agilent 2100生物分析仪(美国agilent公司)鉴定。使用经过验证的文库在illumina miseq平台(中国深圳bgi)上按照illumina标准管道进行测序，并产生2×300 bp 的双端读数。

美吉生物一站式科研服务平台(http://www.majorbio.com/)的物种组成分析选项功能中物种venn图分析，统计多组或多个样本中所共有和独有的物种(如otu)数目，可以比较直观地展现不同环境样本中物种(如otu)组成相似性及重叠情况；物种组成分析选项功能中群落组成分析，在不同分类学水平上统计各样本的物种丰度。根据线性判别分析(liner discriminant analysis，lda)进行lefse 多级物种差异判别分析，找出组间在丰度上有显著差异的物种。基因组功能预测与分析应用picrust(picrust流程存储了greengene id对应的cog信息和ko信息)对otu丰度表进行标准化，即去除16s marker gene在物种基因组中的copy数目的影响；然后通过每个otu 对应的greengene id，获得otu对应的cog家族信息和kegg ortholog (ko)信息；并计算各cog的丰度和ko丰度。根据cog数据库的信息，可以从eggnog数据库中解析到各个cog的描述信息，以及其功能信息，从而得到功能丰度谱；根据kegg数据库的信息，可以获得ko、pathway、ec信息，并能根据otu丰度计算各功能类别的丰度。此外，针对pathway，运用picrust可获得代谢通路的3个水平信息，并分别得到各个水平的丰度表。

数据采用excel 2021进行初步处理，采用spss 21.0软件anova过程进行单因素方差分析，试验数据用“平均值±标准差”表示，