冉宏标，王 会 *，柴志欣，王嘉博，张 明，蔡 欣，钟金城*

(1.西南民族大学 青藏高原动物遗传资源保护与利用四川省/教育部重点实验室，成都 610041；2.西南民族大学青藏高原研究院，成都 610041)

牦牛()是我国青藏高原地区重要的牛种，具备抗逆性强、耐低氧和高压、抗强紫外线特点等。牦牛肉极低的肌内脂肪含量严重影响牦牛肉口感、嫩度、肉色及风味，制约了牦牛肉产业的发展。肌内脂肪沉积的影响因素有品种、年龄、营养、管理等，研究表明其遗传力为0.36～0.54，属于中高遗传力性状；且营养与管理等因素也是通过调控基因表达及蛋白修饰等方式影响肌内脂肪含量。因此，阐明牦牛肌内脂肪沉积的调控机制对于牦牛优良品种选育和牦牛肉品质改善及牦牛产业健康发展具有重要的社会经济意义。

mir-138作为一种肿瘤抑制因子，在疾病的发生与干预过程中得到了广泛研究。研究表明，mir-138表达水平在肥胖患者结肠和血清中都呈显著下调，对肥胖及正常孕妇羊膜间充质干细胞进行测序分析发现，mir-138-5p在肥胖孕妇羊膜间充质干细胞中的表达显著高于正常孕妇，通过生物信息学分析发现，mir-138靶基因的kegg pathway富集于脂肪细胞分化、脂肪沉积和脂肪代谢等通路。mir-138在人脂肪间充质干细胞(had-mscs)成脂分化过程中被显著下调，当mir-138过表达时可靶向负调控e1a样分化抑制因子1(-1)的表达，从而抑制had-mscs成脂分化，减少脂滴沉积。这些研究表明，mir-138在动物脂肪生成过程中具有重要的调控作用。且在黄牛上的研究结果表明，不同品种间肌内脂肪差异表达基因也存在较大差异，提示不同品种对肌内脂肪代谢调控存在特异性。因此，研究mir-138对牦牛肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响对揭示牦牛肉低肌内脂肪含量形成的机制具有重要意义。

本研究旨在利用过表达和干扰技术探究mir-138对牦牛肌内前体脂肪细胞增殖、分化及脂质沉积的影响；利用生物信息学分析预测mir-138在牦牛脂肪生成过程中的潜在靶基因，初步筛选mir-138在脂质沉积中的下游调控靶基因并进行验证，为阐明mir-138在牦牛肌内脂肪沉积过程中的遗传调控机制、构建相关的调控网络奠定基础和提供数据支持。

dmem/f12(1∶1)基础培养基购自hyclone公司；hbss缓冲液购自gibco公司；0.25%胰蛋白酶和青霉素/链霉素(双抗)购自博士德(北京)公司；i型胶原酶、ii型胶原酶、油红o染料和油酸试剂均购自sigma公司；4%多聚甲醛购自biosharp生物科技公司；depc水、pbs溶液、胎牛血清和lipofectamine3000购自赛默飞(thermo fisher scientific)公司；反转录及定量pcr试剂盒购自takara公司；pi试剂购自索莱宝科技公司；cck-8试剂盒和trizol试剂购自天根生物；mir-138 mimics、inhibitor及引物均由擎科生物公司合成。

倒置光学显微镜购自蔡司(zeiss)公司；水浴锅(hws-240)；多功能酶标仪(thermo fisher scientific varioskan lux)；荧光定量pcr仪(thermo fisher scientific quantstudio 3.0)；流式细胞仪(sysmex cyflow cube 8)。

称取0.1 g油红o染色液溶于100 ml异丙醇制成油红o染色原液，于4 ℃冰箱避光保存，染色前按(原液)∶(灭菌水)=3∶2配制并过滤；称取0.1 g Ⅰ型胶原酶和0.1 g Ⅱ型胶原酶分别溶于100 ml hbss缓冲溶液，过0.22 μm除菌过滤器后，按(0.1% Ⅰ型胶原酶)∶(0.1% Ⅱ型胶原酶)=2∶1比例配制组织消化液；完全培养基(10%血清+1% 双抗的dmem/f12基础培养基)；诱导分化培养基(10% 血清+1% 双抗+50 μmol·l油酸的dmem/f12基础培养基)。

1.4.1 牦牛前体脂肪细胞分离 于都江堰(成都)辉润屠宰场采集新鲜屠宰的，年龄约2岁的健康麦洼牦牛的背最长肌，使用含3%双抗冰pbs缓冲液清洗样本数次至无血渍，转移至含3%双抗基础培养基中于冰上带回实验室，使用含2%双抗的pbs缓冲液清洗采回的组织样本，在pbs湿润环境下使用无菌剪刀剔除肉眼可见筋膜、血管，将剩余组织剪碎至1 mm大小肉糜；按(组织)∶(消化液)约为2∶1加入消化液，于37 ℃水浴消化4 h，期间每5 min混匀1次；消化结束后依次过70 μm和40 μm细胞筛，取滤液2 000 r·min离心5 min，使用无血清dmem/f12基础培养基重悬沉淀，并依次1 800、1 500 r·min梯度离心5 min，沉淀加入完全培养基重悬后转移至培养皿，37 ℃恒温培养箱(50 ml·lco)贴壁1.5 h后更换新鲜培养基，之后每2 d更换培养基培养至传代及冻存。

1.4.2 mimics、inhibitor设计合成及转染浓度筛选 参照bta-mir-138成熟序列(mimat 0003813)设计mimics和inhibitor，交由擎科(北京)生物公司合成。设置30、50、100和150 nmol·l共4个浓度，待肌内前体脂肪细胞培养至第三代(f3)开始转染。细胞按参考接种量接种至12孔板，设置mimics、mimics nc、inhibitor、inhibitor nc 组，每组3个重复，待细胞密度达80%～90%时参照lipofectamine3000说明书进行mimics、mimics nc、inhibitor、inhibitor nc转染。37 ℃恒温培养箱转染6 h后更换诱导培养基诱导分化48 h，收集细胞并提取总rna用于测定mir-138表达情况，筛选转染效率最优浓度用于后续试验。

1.4.3 mir-138靶基因预测及功能分析 利用在线预测网站targetscan7.2(http://www.targetscan.org/vert_72/)、mirwalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)和mirdb(http://www.mirdb.org/)对bta-mir-138靶基因进行预测，并对预测结果取交集；利用david数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对预测靶基因进行kegg和go富集分析，筛选脂质代谢过程相关的潜在靶基因。

1.4.4 总rna提取及cdna合成 按trizol法提取细胞总rna，具体方法参照说明书。mir-138 定量用cdna合成参照primer rt reagent kit with gdna eraser说明书(takara rr047a)进行，mir-138反转录引物为5′-ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagt-tgagcggcctga-3′；内参6引物参照前人研究。

1.4.5 实时荧光定量(qpcr) 使用tb greenpremix ex taqii试剂盒(takara rr820a)进行qpcr试验，定量引物序列信息见表1。反应体系为95 ℃预变性30 s;95 ℃变性10 s，60 ℃(引物退火温度详见表1)退火30 s，共40个循环。分别以6和作为mir-138及目的mrna内参，采用2法计算相对表达量。

表1 qpcr引物信息table 1 qpcr primer information

1.4.6 油红o染色 细胞诱导分化后进行油红o染色测定细胞脂滴积累情况：吸去培养基后使用pbs轻柔冲洗细胞，每孔加入500 μl 4%多聚甲醛，室温固定1 h；使用无菌ddho轻柔冲洗细胞3次，加入油红o染液室温染色30 min；无菌ddho冲洗细胞5次，每次1 min，至无明显红色背景，镜检拍照。转染后细胞参照正常细胞诱导分化时间点和染色步骤进行油红o染色，用于检测mir-138对细胞脂质沉积的影响。镜检完成后每孔加入200 μl异丙醇萃取细胞中油红o染色液，于510 nm波长下测定萃取液od值。

1.4.7 细胞增殖活性测定 转染后细胞接种至96孔板，加入新鲜完全培养基培养分别在12、24、36和48 h后进行cck-8测定：向每孔中加入10 μl cck-8试剂，37 ℃培养箱孵育1 h，恢复室温后于480 nm波长下测定od值。划痕试验待细胞密度达80%～90%时进行：使用无菌枪头沿贴壁细胞中轴匀速划出划痕，分别培养12、24和36 h后观察细胞增殖情况并拍照。

1.4.8 流式细胞周期检测 细胞培养至12孔板，待细胞密度达80%～90%时进行转染；48 h后使用胰蛋白酶消化收集细胞，pbs清洗细胞沉淀并加入70%乙醇于4 ℃过夜固定细胞；加入浓度为100 μg·ml的pi染料室温避光孵育30 min后上机检测。

1.4.9 双荧光素酶报告试验 根据targetscan7.2数据库预测结合位点，参考-1序列设计3′ utr扩增引物(f：5′-aaccattcttttcctttctc-3′，r：5′-atacctgcatttaacctaca-3′)，用于扩增包含结合位点3′ utr序列，连接pmd-19t载体后转化感受态细胞，扩大培养并测序验证。设计突变引物fm：5′-gcattcatttatagcatattgtgttc-agagtgaatccactgtctgtcctgtcgg-3′；rm：5′-aacacaatatgctataaatga-atgcagctttcaaaattagctgcattggcc-3′(粗体为突变位点)。采用overlap pcr完成结合位点突变，回收片段并转化感受态细胞，扩大培养并提取质粒用于测序验证。使用i和ii双酶切构建野生型表达载体(-1-wt-pgl3-basic)和突变型表达载体(-1-mut-pgl3-basic)。利用lipofectamine3000将mir-138 mimics或mimics nc与双荧光素酶表达载体分别共转入牦牛前体脂肪细胞，转染48 h后参照双荧光素酶检测试剂盒(promega e1910)说明书测定相对荧光强度。

1.4.10 数据分析 数据均用“mean±sd”表示，试验结果使用spss 25.0软件进行统计学分析，两组样本采用独立样本检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-way anova)，利用duncan’s 法进行多重比较，使用graphpad prism 8完成数据可视化作图。

原代肌内前体脂肪细胞分离后贴壁1.5 h可观察到前体脂肪细胞呈梭型贴壁生长；培养24 h后细胞数量增多，形态呈梭形或椭圆形；72 h细胞开始融合；培养至第8天，细胞密度达到90%左右，呈梭形、螺旋状排列，此时开始传代培养。对f3代细胞诱导分化鉴定，油红o染色结果显示，诱导分化第8天时，细胞质出现大量脂滴积累，形成较大脂滴(图1)。获得细胞与实验室前期分离鉴定获得的肌内前体脂肪细胞特征相符，表明成功获得具有分化潜能的牦牛背最长肌肌内前体脂肪细胞。

a. 培养1.5 h，箭头所示为梭形贴壁细胞(100×)；b. 分离培养72 h，细胞开始融合(100×)；c. 诱导分化第8天油红o染色(100×)；d. 诱导第8天脂滴形成情况(400×)a. cell culture for 1.5 h, the arrowheads indicates fusiform adherent cell (100×); b. cell culture for 72 h, cells begin to fusion (100×); c. the oil red o staining after induced differentiation for 8 days (100×); d. lipid droplet formation after induced 8 days (400×)图1 前体脂肪细胞分离鉴定fig.1 preadipocyte isolation and identification

利用rt-qpcr技术分别测定4个不同转染浓度下mir-138相对表达情况，结果显示(图2)，相较nc组，细胞转染mir-138 mimics后mir-138表达量极显著上调(