杨 光，杨 旭，訾晶晶，于建杰，郭 宏，丁向彬，刘新峰,2*，张林林*

(1.天津农学院动物科学与动物医学学院 天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 300384；2.宁夏大学 西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，银川 750021)

动物的肌肉发育包括胚胎期和出生后肌纤维的增殖和肥大两个方面，是一个长期发展的生物过程并由众多基因协作调控。部分品种的牛(如比利时蓝牛)，其肌肉增大是由于肌肉纤维显著增多，而胰岛素样生长因子(igfs)则能够促进成肌细胞的增殖；小鼠在缺失肌生成抑制素基因(-8)后，肌肉纤维数量增多，进而增强其骨骼肌质量。骨骼肌是肌肉的重要组成部分，存在于生物体的各种组织中，也是呼吸、代谢等生理过程中不可或缺的组成要素。骨骼肌的生长发育伴随着众多基因的共同调控，骨骼肌卫星细胞是肌源性干细胞，在动物机体受到损伤时，可以增殖、分化为新的肌纤维、形成新的肌肉组织。在畜牧生产过程中，动物的产肉性能是决定经济指标的重要因素之一。从不同层面研究肌肉的生长发育调控网络有助于了解和提升动物的产肉性能。

核不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins,hnrnps)是一类由rna聚合酶Ⅱ产生并且与转录物结合的核蛋白，是一类参与了多种重要生命活动的rna结合蛋白。hnrnps家族成员约有20多个，按分子量大小命名从a到u，主要成员包括 hnrnpa、hnrnpa/b、hnrnpc 等，hnrnps的生物学功能较为广泛，它能够利用其自身特有的结构同前体mrna相结合，以两者复合体的形式参与mrna的剪接、翻译、mrna的稳定以及转录等调控过程，还有少部分未命名的成员由于表达较少并且不具备与前体mrna结合的能力从而负责协助其他hnrnps完成部分生物学功能。hnrnp蛋白能够进行翻译后修饰，从而使生物活性及亚细胞定位发生改变。其在基因表达调控中同样发挥重要作用，研究表明许多hnrnps参与癌症的发生和转移，例如hnrnp a1在肺癌样本中的表达显著增加，并与肿瘤的增殖有关；hnrnp a2/b1可以显著提升癌细胞的增殖从而促进人乳腺癌细胞的侵袭；hnrnp c能够调节乳腺癌的致癌基因等。在肌肉发育方面，hnrnp a1能够调控小鼠肌肉相关基因的表达和选择性剪接，从而影响肌肉收缩；降低小鼠骨骼肌中hnrnp a1的表达能够通过抑制糖原合成影响该组织的代谢特性和胰岛素敏感性；hnrnp h在胚胎间充质细胞中高表达，并且在胚胎间充质细胞向平滑肌细胞分化时，hnrnp h的表达显著降低，表明hnrnp h在平滑肌的生成调节中具有重要作用；hnrnp l对肌源性分化具有重要作用，并能够作为潜在的治疗靶点调节肌强直性营养不良病等；hnrnpab作为hnrnps家族的核心蛋白，由两段rna识别基序、一段rgg盒以及两段富含甘氨酸结构域的辅助区域构成，其中的rna识别基序约由90～100个氨基酸组成，能够与pre-mrna的3′非翻译(3′utr)区域结合，而富含甘氨酸的区域在核定位功能上具有重要作用。hnrnpab在生物学功能上主要参与调控mrna转运、代谢及剪切等过程，并且与诸多恶性肿瘤的发生发展密切相关。但hnrnpab参与动物骨骼肌发育的研究鲜有报道。基于此，本研究利用牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型，通过干扰牛骨骼肌卫星细胞中的表达，研究hnrnpab对牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化的作用，为进一步挖掘影响牛肌肉发育的基因奠定一定基础。

牛骨骼肌卫星细胞由天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室分离冻存。

荧光显微镜(leica)；co培养箱(sanyo)；脱色摇床(ika)；酶标仪(thermo-scientific)；垂直电泳槽(bio-rad)；lightcycle 96 实时荧光定量pcr仪(roche)；powerpac basic电泳仪；chemidocimaging system(bio-rad)等。

胎牛血清(fbs)和马血清(hs)(gibco, usa)；pbs 缓冲液、0.25%胰蛋白酶(solarbio, 北京)；dmem高糖培养基(hyclone, usa)；edu细胞增殖检测试剂盒(锐博，广州)；rna快速提取试剂盒(艾德莱，北京)；bca试剂盒(康为世纪，北京)；page凝胶快速制备试剂盒(雅酶生物，上海)；鼠抗gapdh，羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗(中杉金桥，北京)；兔抗 hnrnpab(abcam, usa)；prime ii 1 st strand cdna synthesis kit(takara，大连)等。

1.4.1 牛骨骼肌卫星细胞的复苏、传代及诱导分化 牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型的建立参考天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室建立的方法，液氮中取出细胞，37 ℃水浴快速摇晃使细胞复苏，用等体积的增殖培养基(20%fbs+80%dmem)中和，立刻转移到离心管中离心10 min(1 000 r·min)，离心后弃上清，加入3 ml增殖培养基重悬，均匀接种于60 mm细胞培养板，当细胞融合度达到80%，细胞量约为1×10时传代，用胰酶进行消化，增殖培养基中和以终止消化，差速离心收集沉淀，加入增殖培养基重悬后接种于6孔和24孔板中培养，24 h后收取增殖期细胞(gm期细胞)。细胞融合度达到80%～90%后，换分化培养基(2%hs+98%dmem)进行体外诱导分化，培养24、48、72 h后收取分化期第1(dm1)、2(dm2)、3(dm3)天的细胞。

1.4.2干扰效果检测 根据的cds区序列设计干扰rna(序列为：ccaaagaggtttatcaaca)，由广东锐博公司合成。将细胞培养于24孔板和6孔板中，设置试验组和对照组，每组3个重复，细胞融合度达80%，细胞量约为1×10时参考lipofectamine3000说明书转染si-hnrnpab及对照。转染24 h后收取增殖期(gm)细胞，同时更换增殖培养基为分化培养基，换分化培养基24、72 h后分别收取分化第1天(dm1)和第3天(dm3)的细胞。通过qrt-pcr技术和western blot技术检测gm期、dm1期和dm3期的干扰效果。

1.4.3 edu染色法检测细胞增殖 按cell-lightedu apollo 567 in vitro kit说明操作edu染色试验，于96孔板中培养细胞，转染24 h后对细胞进行处理，利用荧光显微镜检测阳性细胞数，每组设置3个生物学重复，荧光显微镜拍照存图，每孔至少采集5个不同视野。

1.4.4 荧光定量 pcr 检测基因表达 24孔板中培养细胞，收取细胞后按照试剂盒说明书提取总rna，rna浓度检测合格后进行反转录，利用prime ii 1 st strand cdna synthesis kit进行cdna第一链的合成，稀释cdna 5倍后进行qrt-pcr检测的mrna表达水平、7、1(增殖标志因子)和、(分化标志因子)的mrna表达水平。荧光定量pcr体系(总20 μl)：cdna 2 μl，上、下游引物各 0.5 μl，mix 10 μl，rnase free water 7 μl。荧光定量pcr 程序：95 ℃预变性60 s；95 ℃变性10 s；61 ℃退火20 s；72 ℃延伸15 s，40 个循环；熔解曲线：95 ℃ 10 s；65 ℃ 60 s；97 ℃ 1 s；冷却：37 ℃ 30 s。qrt-pcr反应引物详情见表1。

表1 qrt-pcr 引物信息table 1 qrt-pcr primers information

1.4.5 western blot 检测蛋白表达 6孔板中培养细胞，待转染处理48、96 h后，加入含1% pmsf的ripa 裂解液收集蛋白，4 ℃超速离心10 min后取上清液保存于-80 ℃。根据bca试剂盒测定蛋白浓度后对蛋白进行变性，根据蛋白浓度利用western blot检测hnrnpab、pax7(增殖标志因子)、myog、myhc(分化标志因子)的蛋白表达量。

1.4.6 统计分析 qrt-pcr及western blot结果用检验分析(spss和image lab),edu细胞增殖试验采用检验分析(imagej软件进行细胞计数)，“*”表示差异显著(