甘建宇，张 芯，蔡更元，洪林君，黄思秀

(华南农业大学动物科学学院 国家生猪种业工程技术研究中心，广州 510642)

猪在体型、生理和基因组特征上与人类相似，被认为是人类疾病研究的最佳动物模型。作为主要的产肉家畜，商品猪的产仔数一直以来都是重要的经济指标，而产仔数的多少与胚胎是否能发育正常有着重要的联系。猪的胚胎发育是一个复杂的生理过程，需要经历一系列重要的生理阶段以及自发胎儿丢失、宫内生长受限等严峻的考验后才能幸运地发育成新生儿，这导致了猪胚胎产前死亡率高达20%～45%。虽然在胚胎发育过程中基因的严格表达与正确指导是胚胎能否正常发育的决定性条件，但是近年来的研究发现，表观遗传调控对胚胎的发育也起着必不可少的作用。

表观遗传学是指细胞核dna序列没有改变的情况下，个体全基因组功能发生可遗传和可逆的改变。研究表明，表观遗传修饰并不局限于生物体的特定生命阶段，而是贯穿整个生命周期。然而，它们更常见于胚胎发育和细胞增殖阶段。在生殖细胞和早期胚胎中，表观遗传重编程发生在全基因组范围内。通过这些表观遗传机制，细胞整合环境刺激来协调基因转录，基因表达等生理过程，对猪的胚胎发育至关重要。本文总结了目前研究得最成熟的表观遗传修饰——dna甲基化，在猪胚胎发育过程中的研究进展，为今后进一步了解和研究dna甲基化及其与其他表观遗传修饰的串扰在胚胎发育的作用提供借鉴和参考。

受精卵的形成标志着哺乳动物胚胎发育的开始。在最初的4 d里，猪的胚胎独立于母体环境进行卵裂分裂，储存在卵母细胞中的编码细胞周期和核酸合成调节因子的mrna和蛋白质维持着这一早期胚胎发育。但大约在第3天(4细胞期)时，胚胎基因组开始激活，随后自主指导自身的发育，直到囊胚形成。

大约在受精后第7天，胚胎从透明带中孵化出来，随后继续增殖发育，第10天时直径扩大到2～6 mm。从妊娠第10天开始，胚胎的形态开始发生剧烈变化，从球状囊胚首先转变成管状胚胎，然后在妊娠第12天左右发育成丝状(100～150 mm)，并进一步伸长，在妊娠第16天左右达到了1 000 mm。伸长后的胚胎能显著增加与子宫内膜的接触面积，从而为胚胎后续的附植提供了条件。

妊娠第11～13天是妊娠识别的关键时期，此阶段胚胎开始分泌能启动胚胎-母体识别的信号——雌二醇来完成识别过程。成功进行妊娠识别后，胚胎开始进入附植窗口期，并在妊娠第18天左右完成附植过程。此时胚胎滋养层上皮与子宫腔上皮相互黏附，胎盘开始建立。大约在妊娠28 d，胎盘完全形成，标志着猪的妊娠早期阶段结束。

在妊娠中期时，胎盘基质层的厚度显著增加，并且形成褶皱结构。褶皱的形成大大增加了胎盘与母体子宫的接触面积，从而使营养物质的运输效率显著提高，为胎儿的进一步发育提供了条件。进入妊娠中期后，胎儿中已分化的器官继续发育完善，体重在妊娠后期迅速增加，并在分娩前体重达到最高水平。猪的胚胎发育过程中的其他重要事件总结如图1所示。

ega. 胚胎基因组激活；ppgcs. 猪原始生殖细胞ega. embryonic genome activation; ppgcs. porcine primordial germ cells图1 猪胚胎发育过程中重要事件fig.1 the crucial events during porcine embryonic development

dna甲基化是一种常见且重要的表观遗传修饰，虽然不改变 dna 的一级序列，但也包含可遗传信息，并在基因的转录调控中起重要作用。3种不同的dna甲基转移酶(dna methyltransferase, dnmt)dnmt1、dnmt3a和dnmt3b催化dna甲基化，其中dnmt1是主要的维持甲基化酶，dnmt3a和dnmt3b则负责从头甲基化。而近年来发现dnmt1在卵母细胞中也可以介导从头甲基化的过程。当甲基以时间和空间的精度被添加到除位于cpg岛上的cpg二核苷酸中的5′-胞嘧啶残基位置时，部分生物学过程会随之被改变，例如基因转录、基因组印记、组织分化和表型变异。此外，在非cpg位点也发现了dna甲基化，这被称为非cpg甲基化，可由dnmt3a和dnmt3b介导。目前已经在人类胚胎干细胞中发现了非cpg甲基化的存在。

dna甲基化在分化的体细胞中相对稳定，但在哺乳动物的早期胚胎发生中是高度动态的。在受精过程中，高度甲基化的精子(内含父本基因组)经历了快速的主动去甲基化过程，这一过程主要由tet甲基胞嘧啶双加氧酶(tet methylcytosine dioxygenase, tet)来介导。由于dnmt1不能进入细胞核，因此随着胚胎继续发生卵裂，其去甲基化继续以被动的形式发生，并在囊胚中达到整个胚胎发育过程的最低水平。从头甲基化(methylation)是早期胚胎发育的主要dna甲基化模式，在dnmt3a和dnmt3b的介导下从猪的早期囊胚(受精后第5天)开始，并在附植期间建立。有报道还观察到了在第7～8天的囊胚中出现系谱特异性的dna甲基化，其中甲基化的主要部位是内细胞团，其次是滋养外胚层。胚胎在附植前发生的第一次dna甲基化重编程(dna methylation reprogramming，dmr)消除了配子发生过程中所积累的与分化相关且不必要的表观遗传信息，从而使胚胎获得了能独立发育成一个新个体的多能性。与小鼠和人一样，猪在ppgcs分化形成后不久也会发生第二次dmr，并且这一过程所持续的时间较长。在从后肠迁移到性腺脊期间(妊娠约15～22天)，高度甲基化的ppgcs开始去甲基化，并在第20天左右达到较低水平，随后开始重新升高，在28天时重新达到一个较高水平。但在28天后，pgc中的甲基化程度重新降低，并在妊娠中期的第36天左右达到第二个低水平，随后继续升高，在第42天时恢复至第28天左右的水平(图2)。随着上一代建立的dna甲基化印记的消除，dna甲基化模式在胚胎发生过程中通过dnmt3a和非催化旁系同源物dnmt3l在印记基因座和转座因子上重新建立。重编程的去甲基化过程涉及5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5 mc)的修饰和dna修复。在这一过程中，5 mc修饰可以通过不同的机制(例如tet1介导的羟基化)来介导，从而启动主动去甲基化过程。但与第一次全基因组dmr不同，ppgcs中的dmr只是局部基因组的去甲基化和擦除，并根据胎儿的性别形成了印记。有研究发现，在妊娠第30和第45天猪胚胎的1(