基质细胞衍生因子—1刺激对周期性牵张力作用下ATDC5细胞的趋化因子受体4、白介素—6、胶原X表达的影响
匡斌 王庆昱 宋容 等
[摘要] 目的 探讨诱导后atdc5软骨细胞在20%形变的周期性牵张力及基质细胞衍生因子-1(sdf-1)刺激下,趋化因子受体4(cxcr4)、白介素(il)-6及胶原x的表达变化,以期深入研究sdf-1/cxcr4信号轴在软骨细胞分化中的作用机制。方法 atdc5细胞系经胰岛素铁硒传递蛋白(its)诱导3周后,分为加力和不加力两大组,每大组又分为对照组和sdf-1组。对加力组施以20%形变的拉伸力12 h。加力结束后,对各组细胞提取总蛋白,对cxcr4、il-6及胶原x的蛋白表达进行western blot检测。结果 在不加力状态下,给予sdf-1刺激后,软骨细胞cxcr4、il-6及胶原x的表达都出现了不同程度的增强;而在20%形变力和sdf-1的双重刺激下,此3种因子的表达出现进一步增强。结论 在异常应力作用下,sdf-1可通过上调其特异性受体cxcr4的表达进而增大与其结合的效率,最终促使sdf-1/cxcr4信号轴的激活,促进il-6等炎症因子的表达增强,以及直接促进软骨细胞的肥大向分化,进而胶原x的表达量增高。
[关键词] 颞下颌关节骨关节病; 基质细胞衍生因子-1; 趋化因子受体4; 周期性张应力
[中图分类号] q 257 [文献标志码] a [doi] 10.7518/hxkq.2014.06.015
在关于颞下颌关节骨关节病(osteoarthritis,oa)病因的討论中,异常机械应力越来越受到人们的关注。应力对髁突软骨细胞而言是一种外源性机械刺激信号,在异常应力作用下,髁突软骨细胞可分泌多种细胞因子,可能对关节组织造成损害。基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,sdf-1)/趋化因子受体4(chemokine receptor 4,cxcr4)相互作用时,通过诱导促炎细胞因子的释放如白介素(interleukin,il)等而引起oa软骨的破坏[1]。atdc5细胞是从at805胚胎瘤中分离的软骨前体细胞系,其为软骨内成骨过程提供了一个良好的软骨细胞矿化成熟体外细胞实验模板,广泛应用于软骨细胞调控机理的研究。本研究拟通过体外诱导atdc5细胞分化为软骨细胞,并进行周期性张应力及sdf-1刺激,并分别检测cxcr4、il-6及胶原x的表达变化,以期在前期实验的基础上,进一步探讨sdf-1/cxcr4信号轴在oa中的作用机制。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器
sdf-1(peprointech公司,英国),抗-cxcr4抗体(兔单克隆来源,abcam公司,美国),抗-il-6抗体(兔多克隆来源)、抗-胶原x抗体(山羊多克隆来源)(santa cruz公司,美国),atdc5细胞系(苏州百奇生物科技有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 atdc5细胞系的培养和诱导 atdc5细胞置于培养基(dmem/f12)中,加入10%胎牛血清、
50 u·ml-1青霉素、50 u·ml-1链霉素。细胞每2 d换液1次,保持细胞的对数生长,培养瓶放于37 ℃、5%
co2的细胞培养箱内。待细胞稳定后,更换含有10%胰岛素铁硒传递蛋白(insulin-transferring-selenium,its)的培养液诱导3周。
1.2.2 实验分组 将诱导的细胞消化后分别接种于普通六孔板和弹性膜六孔板中,分为加力和不加力两个大组,每大组又分对照组和sdf-1组(100 ng·μl-1)。加入以上试剂8 h后,将弹性膜六孔板连接到可控气液压细胞加载装置并置于细胞培养箱中,设置为20%形变的拉伸力,0.2 hz。连续加力12 h后,将弹性膜板及普通板上的细胞用专用刮匙取下。
1.2.3 蛋白提取 无菌pbs洗各组细胞3次;加入放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay,ripa)蛋白裂解液;冰上放置20 min;收集裂解液后,
12 000 r·min-1离心10 min;吸取上清,进行总蛋白定量,分装,保存在-80 ℃备用。
1.2.4 western blot检测 蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳60 v电泳1.5 h。电转完毕,取下膜片,加入5%脱脂奶粉,于摇床摇荡封闭1 h以消除非特异背景。封闭完毕,洗掉牛奶,分别加入相应一抗(1︰200),4 ℃ 孵育24 h,使一抗与特异蛋白结合。洗去一抗后,加入相应二抗37 ℃ 孵育1 h,电化学发光试剂盒化学发光后曝光成像。同时以β-
actin作为内参。
2 结果
3 讨论
应力加载是调节细胞新陈代谢的关键因素之
一[2-4]。软骨组织在受到压缩力作用的情况下,由于受到胶原及其他细胞外基质的牵拉作用,软骨细胞实际受到的是一种拉伸力[5]。在正常活动的情况下,关节软骨细胞受到大约5%的伸长[6]。目前国外的研究主要都对软骨细胞施予周期性拉伸力。
软骨细胞对机械负荷极度敏感,关节软骨物理化学环境的动态变化可影响软骨细胞的新陈代谢[7]。以前使用生物拉伸力培养体系研究[8]发现,软骨细胞承受拉伸力时可维持其表型,由加力装置引起的周期性拉伸力可致软骨细胞首先增殖,然后成熟和肥大。加力大小对软骨细胞所产生的效应非常重要。已有研究[9]证明不同强度的加力,可对软骨细胞功能产生不同作用。低强度的拉伸力会促进软骨细胞产生蛋白聚糖、Ⅱ型胶原等细胞外基质作用,甚至可产生抗炎作用。但在高强度拉伸力作用下,既可通过直接激活核转录因子kb通路进而诱导il-1等炎症因子的分泌,也可以直接诱使il-1、基质金属蛋白酶(matrix lloproteinase,mmp)9的生成[10]。高强度周期性拉伸力加载于软骨细胞中,可减少软骨基质的合成,进而导致软骨组织抵抗外来刺激的能力降低。因此在本实验中使用强度为20%的拉伸力对软骨细胞更可能产生一种负面作用。honda等[11]报道高强度周期性拉伸力加载于软骨细胞中,可使细胞形态发生变化,从多边形到纺锤形。而本实验中使用强度为20%的周期性拉伸力时,在经受加力和/或sdf-1刺激后,软骨细胞形态未见明显异常,未发现坏死细胞,细胞排列相对有序。
已有研究[1]表明sdf-1/cxcr4信号通路在oa及类风湿性关节炎患者病理进程中起关键作用。前期动物实验也证明其破坏关节软骨的作用可能是通过骨髓腔及滑膜细胞分泌高浓度的sdf-1,后者再与关节软骨细胞上的cxcr4受体结合,诱导软骨细胞分泌大量的il-6及mmp。相关研究[12]报道,在人类关节炎中,滑膜切除术致sdf-1浓度降低或抗cxcr4抗体阻止cxcr4的表达,会使mmp13表达降低和减弱软骨的破坏。这些研究都有力证明sdf-1/cxcr4信号通路在oa病理进程中的重要作用。本研究结果发现在不加力状态下,给予sdf-1刺激后,软骨细胞cxcr4、il-6的表达都出现了不同程度的增强;而在20%形变力和sdf-1的双重刺激下,此两种因子的表达出现进一步增强。以上结果说明,sdf-1刺激可上调其特异性受体cxcr4的表达,而随着受体的上调,则反过来增加了与配体sdf-1结合的可能性,最终促使软骨细胞sdf-1/cxcr4信号通路的激活,而该信号轴下游因子il-6的表达增强,也证实了这种推测。20%的拉伸力超出了软骨细胞正常的受力范围,这正是为了模拟体内颞下颌关节软骨细胞由于渐进性咬合紊乱而受到的异常力刺激。本实验结果证实此种异常力的确可对软骨细胞cxcr4等的表达产生促进作用,这也与动物实验中的结果相对应。
在机械负荷下,软骨中的胶原x是敏感因子之一[8],本实验中对照组软骨细胞在加力状态下胶原x的表达比不加力时更强,证实在此种异常力作用下,软骨细胞出现肥大化倾向,这也与动物实验中实验组软骨内成骨增强及钙化软骨增厚相一致。此外,sdf-1这种趋化因子似乎还可促进软骨细胞x型胶原的表达,在加力状态下这种趋势仍然明显。这说明sdf-1/cxcr4信号轴可直接调控软骨细胞的分化。
综上所述,軟骨细胞在异常应力作用下,sdf-1可通过上调其特异性受体cxcr4的表达进而增大与其结合的效率,最终促使sdf-1/cxcr4信号轴激活,一方面导致如il-6等炎症因子的表达增强,从而对软骨组织造成直接破坏;另一方面还可直接促进软骨细胞的肥大向分化,从而促进髁突软骨的软骨内成骨,促使其发生间接退变。
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(本文编辑 杜冰)
基质细胞衍生因子—1刺激对周期性牵张力作用下ATDC5细胞的趋化因子受体4、白介素—6、胶原X表达的影响
本文2022-11-02 17:06:44发表“毕业论文”栏目。
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