徐倩　冯青　欧俊　等

[摘要] 目的 构建一种长效、靶向的携带促骨形成药物hu-308的药物缓释种植体，观察其体外缓释特性。方法 采用层层静电自组装技术制备不同层数的肝素/壳聚糖涂层，以物理吸附的方式装载促骨形成药物hu-308，构建载药种植并进行体外释放实验。通过紫外可见光分光光度计测定药物浓度，分析不同涂层数载药种植体的加载效率及释放规律。用扫描电镜、原子力显微镜观察涂层表面形貌和结构的变化。结果 成功地制备了载hu-308涂层种植体。体外释放实验表明，随着涂层层数的增加，载药量逐渐增加，但t20组略有下降。随着层数的增加，hu-308的释放速度随之减缓，缓释能力增强。扫描电镜、原子力显微镜结果表明种植体表面肝素/壳聚糖涂层逐渐形成。结论 层层静电自组装技术成功构建载有hu-308的涂层种植体，可长期有效释放达30 d以上，这有望为临床上提高骨质疏松症患者种植体骨整合率提供一种新的可能。

[关键词] 钛种植体； 药物缓释； hu-308； 层层静电自组装； 肝素； 壳聚糖

[中图分类号] r 783.2 [文献标志码] a [doi] 10.7518/hxkq.2014.06.002

骨质疏松症作为一种全身系统性疾病，影响了颌骨的骨质量和骨密度[1]，进而影响了颌骨种植体的成功率，如何提高骨质疏松症患者的种植成功率一直以来都是人们关注的焦点。传统的全身给药不仅用药量大、有不良反应且作用于种植体局部的效果不佳。纯钛作为牙种植材料，有着良好的机械性能和生物相容性，但其属于惰性材料，缺乏生物活性，无骨诱导和骨传导能力且植入后愈合周期长[2]；因此，很多学者开始研究对种植体表面进行处理，尝试在种植体局部载药来解决这些问题。层层静电自组装技术（ -by- electrostatic self-assembly，lbl）[3]是基于聚电解质阴阳离子所带正负电荷间相互作用的一种自组装超分子技术。其原理[4]是分子静电自组装，通过静电力的作用依次吸附上带异种电荷的聚电解质，交替沉积形成自组装多层涂层，而同时电荷间的排斥力又使每一层的吸附量不会无限增加，而是在一定时间内达到饱和。本实验的研究目的在于构建一种肝素（heparin，hep）/壳聚糖（chitosan，chi）涂层种植体，并装载促骨形成药物hu-308，使其在种植体周围形成较高药物浓度的同时亦可进行缓慢持久的释放，以诱导种植体周围成骨细胞的分化，促进新骨的形成，以期为今后提高骨质疏松患者的种植骨整合率提供一种新的可能。

1 材料和方法

1.1 实验材料和仪器

商业纯钛微种植体，直径2 mm，长4 mm（ta2，纯度99.9%，陕西宝鸡力华公司）。多聚左旋赖氨酸（sigma公司，美国），肝素钠（上海国药集团化学试剂有限公司），壳聚糖（浙江澳兴生物科技有限公司），hu-308（cayman公司，美国）。

双光束紫外可见分光光度计（tu-1901，北京普析通用仪器有限责任公司），扫描电镜（scanning electron microscope，sem）（vega3，tescan公司，捷克），原子力顯微镜（atomic force micros-cope，afm）（ntmdt公司，俄罗斯）。

1.2 钛种植体的碱热水处理

取50颗钛种植体依次置于丙酮-无水乙醇-去离子水中超声清洗，40 ℃干燥。再浸入5 mol·l-1的naoh溶液中80 ℃活化24 h，然后使用去离子水超声清洗

3次，每次10 min。接着将碱处理后的钛种植体浸入60 ℃去离子水中陈化24 h，用去离子水超声清洗，40 ℃干燥备用。

1.3 肝素/壳聚糖涂层的制备及分组

将壳聚糖在1%乙酸中溶解，制成ph=4、质量浓度为5 g·l-1的聚阳离子溶液；肝素溶解在去离子水中，制成ph=4、质量浓度为5 g·l-1的聚阴离子溶液；多聚左旋赖氨酸（poly-l-lysine，pll）溶解于磷酸盐缓冲液（pbs）中，制成ph=7.2、质量浓度为2.5 g·l-1的聚阳离子溶液。将碱热水处理过后的样品浸入pll溶液中30 min，获得一个稳定的带正电的前驱体层，为lbl[3]自组装程序的初始层，去离子水漂洗5 min，氮气吹干；再将样品依次浸入肝素、壳聚糖溶液中，每次浸泡10 min，去离子水漂洗1 min，氮气吹干。重复上述循环n次即可得到最终所要求的自组装涂层ti/pll/（hep/chi）n，每次循环最后一层以壳聚糖层终止。

本实验中50颗钛种植体平均分为5组： t0组（对照组、无涂层）、t5组（5层涂层）、t10组（10层涂层）、t15组（15层涂层）、t20组（20层涂层），每组10颗。按照上述方法制备所需涂层种植体，室温干燥后待用。

1.4 hu-308标准曲线的制作

1.4.1 hu-308吸收标准曲线 将乙醇和pbs按1︰2的比例混合配制成标准的稀释溶剂。然后取一定量的hu-308溶于标准的稀释溶剂中，分别配制成0.25、0.125、0.062 5、0.031 3、0.015 6、0.007 8 g·l-1的一系列梯度浓度的标准液，不含药物的溶液作为空白对照，采用紫外分光光度计测定所配标准溶液在233 nm波长处的光密度值（a值），以a值对浓度c进行回归，获得回归方程a=8.914 3c+0.031 4，r?=

0.999 2。

1.4.2 hu-308释放标准曲线 释放标准曲线的制备方法同吸收曲线，释放溶剂为ph=7.2的pbs缓冲溶液。用同样的方式配制一系列梯度浓度的标准液，紫外分光光度计在233 nm波长处测定a值，以a值对浓度c进行回归，获得回归方程a=4.138 8c-0.027 9，r?=

0.999 1。

1.5 hu-308的装载

将各组钛种植体浸没于促骨形成药物hu-308溶液中，常温下静置，利用物理吸附法负载药物，间隔一定时间取出部分溶液用紫外分光光度计于选定波长处测定其光密度值，直至光密度值无明显变化时停止测量。对照hu-308吸收标准曲线计算出hu-

308的浓度。

1.6 hu-308体外释放实验

常温下配制释放介质pbs缓冲溶液，ph值为7.2。将装载有hu-308的钛种植体浸没到1 ml的pbs缓冲溶液中进行药物体外释放实验，36.5 ℃±0.5 ℃、50 r·min-1 转速的水浴环境下，分别于1～30 d中每隔2 d定时取样，并更换等量pbs溶液1 ml，用紫外分光光度计测量每个时段样品溶液在233 nm处的紫外光密度值，直到无药物释放为止。对照药物释放标准曲线得出每个时点样品浓度c，可以计算出每个时段下的累积释放百分率，绘制累积释放药物质量百分率-时间的药物体外释放曲线，从而分析自组装层数对释药行为的影响。

1.7 表面形貌观察

从每组钛种植体中随机抽取2颗，分别用作sem和afm观察。对碱处理以及涂层改性后纯钛种植体表面进行表征，观察钛种植体表面微观形貌结构的变化。

2 结果

2.1 各组钛种植体hu-308装载量

t0、t5、t10、t15、t20组钛种植体的平均载药量分别为0.140 2、0.163 8、0.164 6、0.167 2、0.164 1 mg；载药百分比分别为61.40%、71.72%、72.09%、73.22%、71.87%。随着涂层层数的不断增加，t0至t15组载药量逐渐增加，但t20组有轻微下降。t0组与实验各组之间载药量差异均有统计学意义（p0.05），t15组与其他组载药量差异均有统计学意义（p