邹 东，杨 阳，黄鹤阳，纪 剑，孙秀兰

（江南大学食品学院，江苏无锡 214122）

赭曲霉毒素a（ochratoxin a，ota）主要是由曲霉菌产生的一种有毒次级代谢产物，广泛存在于各种食品和饲料中，如谷物和谷物制品、干果、葡萄、奶酪和肉制品等，严重威胁人和动物的健康安全。ota分子式为chclno，多种研究表明ota不仅具有肾毒性，还具有肝毒性、致畸性、遗传毒性和致癌性，现已被国际癌症研究机构归类为2b类致癌物。不同食品中的ota含量都具有相应的限量标准，欧盟规定谷物原料最大限量5 μg/kg，谷物加工制品最大限量3 μg/kg，婴幼儿及特医性食品不超过5 μg/kg，对于葡萄干、可溶性咖啡和一些干果的最大允许限值为10.0 ng/g。联合国粮农组织和世界卫生组织暂定ota对人体的每周容许摄入量为100 ng/kg。我国对配合饲料中的ota最高限量为100 μg/kg。据报道，植物源性食品中ota的平均浓度在0.1～100 ng/g之间。由小麦、燕麦、大麦、黑麦等谷物制成的食品及干草/青贮饲料也含有0.1～100 ng/g的ota，在动物源性食品和饲料中，ota的水平在0.1～1 ng/g之间。因此，研究ota的脱毒不可或缺。食品和饲料中的霉菌毒素的方法通常分为物理、化学和生物三种方法。物理和化学方法存在能源消耗大，脱毒过程会对产品造成营养成分的流失，产生各种副产物等缺点，相较于这两种方法，生物法具有可持续性、环保、安全等优势。

麦麸即小麦皮，是优良的氨基酸源，并含有多种矿物质及微量元素。目前，我国小麦麸皮年产量大，最高可达2000万吨，在传统的农业生产中多用于牲畜饲料、食品和药品的加工应用。但麦麸中真菌毒素污染严重，其中包括ota，限制了其在饲料工业中的安全应用。生物发酵麦麸的研究早有报道，发酵后的麦麸营养特性明显提高，还能产生多种有益的生物活性物质，提高饲料的饲用品质。陈洪伟等的研究表明，黑曲霉和酵母菌协同发酵麦麸可以提高其粗蛋白及游离氨基酸含量。同多数麦麸发酵的研究一样，该研究进行了微生物发酵麦麸的营养物质评价，但缺少对麦麸发酵前后真菌毒素及风味物质的变化的研究。黑曲霉降解真菌毒素的有效性及发酵饲料降解真菌毒素的研究此前已有报道，黑曲霉也被证实对ota具有降解作用，然而降解过程均在培养基体系中进行，应用在实际样品中的研究较少。

因此，本研究使用本课题组筛选的一株非产毒黑曲霉菌株fs-uv-21，生物发酵ota污染的麦麸，采用响应面法优化发酵条件，并对最优发酵条件下麦麸发酵前后的挥发性风味物质的变化进行分析。该研究旨在为麦麸资源的安全应用及深度开发提供技术参考。

黑曲霉fs-uv-21 由本课题组筛选并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.20751；麦麸 河北五得利面粉集团有限公司；ota标准品 纯度≥99%，美国默克公司；乙腈、无水乙酸 色谱纯，上海国药集团化学试剂有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（pda培养基）上海博微生物科技有限公司。

agilent 1260 hplc系统 美国安捷伦公司；gi54dws 型高压灭菌锅 美国zealway产品；bsc-1300Ⅱ型超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司产品；phy-dhs*500-bs型恒温培养箱 上海博泰实验设备有限公司产品；pb303型电子精密天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司；ex-ohous型旋涡振荡仪 美国奥豪斯公司产品；scientz-10n型台式冷冻干燥机、scientz-10ls型真空离心浓缩仪 宁波新芝生物科技股份有限公司产品

1.2.1 黑曲霉fs-uv-21菌株活化及孢子悬浮液制备 将黑曲霉fs-uv-21从-80 ℃取出，接种于pda培养基上，在28 ℃恒温培养7 d，再用灭菌后的生理盐水（含0.05%的吐温-80）将洗下黑曲霉孢子作为孢子悬液，并调整浓度至10cfu/ml，备用。

1.2.2 生物发酵法处理麦麸 将麦麸粉碎，过40目筛后收集备用。对粉碎后的麦麸进行采样称重，采样方法参考gb/t 14699.1-2005，精准称取10 g样品置于250 ml三角锥形瓶中，封口膜封口后置于灭菌锅（121 ℃，20 min）中灭菌。

灭菌处理后待麦麸冷却至室温后，分别加入无菌水（含ota标准品）和fs-uv-21孢子悬液，搅拌均匀，麦麸中ota终含量为1 μg/g。恒温有氧发酵，取样待检测。对灭菌后的麦麸及加标后的麦麸进行取样检测，确定ota的加标回收率。

1.2.3 麦麸中ota的测定 参考gb 5009.96-2016对麦麸中ota进行提取和检测。配置ota标准溶液：质量浓度梯度为 10、25、50、100、250、500、1000、2000 ng/ml。

液相色谱条件优化，条件如下：使用c反相柱（thermo hypersil gold c，150 mm×4.6 mm，3.5 μm）和荧光检测器（fld，=333 nm 和=460 nm；增益=100），通过hplc分析提取物。进样量为20 μl，样品以1 ml/min的流速洗脱，流动相为乙腈/水/乙酸的混合物（99:99:2，v/v/v），柱温为 30 ℃，洗脱时间为15 min。

1.2.4 单因素实验设计 fs-uv-21孢子悬液浓度固定为10cfu/ml，分别探究料水比（麦麸质量与无菌水体积的比值，g/ml）、接种量（孢子悬液体积与麦麸质量的百分比，%）、温度（麦麸发酵温度，℃）及时间（麦麸发酵时间，d）等因素对ota脱除率的影响，试验设计如下：接种量分别为1%、5%、10%、15%、20%，发酵温度 30 ℃，发酵时间 4 d，料水比为1:3 g/ml；发酵温度为 20、25、30、35、40 ℃，接种量为10%，发酵时间4 d，料水比为1:3 g/ml；发酵时间为 2、3、4、5、6 d，接种量为 10%，发酵温度30 ℃，料水比为 1:3 g/ml；料水比为 1:1、1:2、1:3、1:4、1:5 g/ml，接种量为 10%，发酵温度 30 ℃，发酵时间4 d。分别进行实验，检测麦麸中ota的脱除率。

ota脱除率计算方法为：ota脱除率（%）=（未发酵样品中ota含量-发酵后样品中ota含量）/未发酵样品中ota含量×100

1.2.5 响应面法因素水平试验设计 参考上述单因素实验的结果，应用box-behnken设计方法和响应面处理软件，选择接种量（a）、发酵温度（b）、发酵时间（c）、料水比（d）作为响应变量，设计四因素三水平试验，以ota脱除率作为响应值进行响应面优化设计。响应面试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平设计table 1 factors and levels of response surface test

1.2.6 麦麸生物发酵前后挥发性物质检测 利用顶空固相微萃取风味物质。取5 g接种发酵后的麦麸样品置于40 ml顶空进样瓶中密封，将顶空进样瓶置于加入加热装置中30 min，再将萃取头插入瓶中，距离1 cm处进行萃取，萃取后立即进样。萃取温度为50 ℃，萃取时间为30 min，解析时间为5 min。

采用气质联用检测风味物质，色谱毛细管柱为equity-5柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），使用以下温度程序：主烤箱温度范围从40～140 ℃，以10 ℃/min升温，然后到200 ℃，以7 ℃/min升温，进样口温度为250 ℃。载气为氦气，流速为2.5 ml/min，无分流。电离方式为ei，电子能量为70 ev，检测器电压为-1499 v，m/z范围为15～350。使用自动数据处理软件chroma toffi （leco）以200的信噪比阈值处理总离子色谱图。

graphpad prism 8.0、spss 26、design expert11软件用于数据的统计分析。数值显示为三个实验的平均值±sd，每个实验进行三次。

提取加标前后麦麸中ota的实验结果如表2所示，加标前麦麸中未检测出ota。加标后的麦麸中ota含量理论上为1 μg/g，实际检测结果显示加标麦麸中ota含量平均为0.9878 μg/g，表明ota的加标回收率较好。

表2 麦麸中ota的含量table 2 ota content in wheat bran

2.2.1 接种量对ota脱除的影响 由图1可见，黑曲霉fs-uv-21的接种量对麦麸中ota的脱除率有显著影响（＜0.05）。在接种量为15%时，ota的脱除率最高，在接种量为1%～15%的区间内，ota的脱除率都随着接种量的增加而升高。然而接种量为20%时，ota的脱除率明显降低，说明接种量过大或过小都不利于麦麸中ota的生物脱除。接种量过小时，发酵体系内黑曲霉较少，会延长发酵周期，而接种量过大时，黑曲霉菌之间生存竞争加大，很可能导致菌株在发酵体系中的生长受抑制。因此，接种量的选择应在15%左右。

图1 接种量对黑曲霉脱除ota的影响fig.1 effect of inoculation amount on the removal of ota by aspergillus niger

2.2.2 发酵温度对ota脱除的影响 温度对黑曲霉的生长及代谢产生极大的影响，在不同的发酵体系中，黑曲霉的最适发酵温度不一定相同。因此，试验研究了在麦麸发酵体系中不同发酵温度对黑曲霉脱除ota的影响。根据图2可知，在20～30 ℃的温度区间内，ota的脱除率随温度的提高而升高，在30 ℃时脱除率最高为51.71%。当温度超过30 ℃，黑曲霉的脱除能力明显降低，很可能偏离了黑曲霉的最适生长温度，影响了发酵体系内微生物的生长，无法形成良好的酶系，也可能黑曲霉内转化ota的酶活性被抑制，导致ota脱除率的降低。因此，选择30 ℃左右为麦麸体系的响应面优化水平。

图2 发酵温度对黑曲霉脱除ota的影响fig.2 effect of fermentation temperature on the removal of ota by aspergillus niger

2.2.3 发酵时间对ota脱除的影响 微生物的生长及生理活性与培养时间密切相关，因此微生物发酵体系内，发酵时间也是需要控制的重要因素之一。在其他条件不变的情况下，从图3可以看出ota的脱除率随着发酵时间的增加而升高，在第5 d时脱除率为59.74%，第6 d的ota脱除率（59.85%）与第5 d相比无显著增加（＞0.05）。因此，选择发酵时间为5 d左右。

图3 发酵时间对黑曲霉脱除ota的影响fig.3 effect of fermentation time on the removal of ota by aspergillus niger

2.2.4 料水比对ota脱除的影响 发酵过程中，体系含水量也是菌体正常生长发育的关键因素之一。如果含水量过低，微生物没有足够可利用的水进行生理活动；而含水量过高则会导致传质和传氧困难。因此，适宜的料水比对麦麸中ota的脱除也至关重要。由图4可知，随着水含量的增加，ota的脱除率先升高后下降，料水比为1:3 g/ml时脱除率最高为51.43%。故选取1:3 g/ml作为0水平进行响应面试验。

图4 料水比对黑曲霉脱除ota的影响fig.4 effect of ratio of material to water on the removal of ota by aspergillus niger

2.3.1 响应面试验设计因素与水平 根据上述单因素实验结果，可以得到接种量、料水比、发酵时间、发酵温度四个因素的较优水平，采用响应面法对四个因素三水平进行试验设计，各因素两两交互影响。以ota脱除率为指标，最终得到黑曲霉发酵脱除麦麸中ota的最佳条件。响应面试验设计及结果见表3。

表3 响应面试验设计及结果table 3 response surface test design and results

2.3.2 响应面回归模型的建立与分析 利用design expert 11对响应面实验结果进行分析，可以得到以ota 脱除率（y）为响应值，接种量（a）、发酵温度（b）、发酵时间（c）、料水比（d）的二次多项回归模型：

y=57.5760+0.3542a+3.5483b-0.1842c+0.9317d-0.0450ab-0.5125ac-1.2450ad-1.5750bc+3.6400 bd+0.5200cd-3.1405a-7.879b-2.7605c-3.6692 d2

为了检验回归模型的有效性和可靠性，回归模型的方差和显著性分析结果见表4。

结果表明，回归模型高度显著（＜0.01），失拟项不显著（＞0.05），为 0.8531，表明该模型拟合性较好，可较好的预测分析并能够反映各因素水平与响应值之间的关系。因此，由表4可知，试验影响因素的主次排序如下：发酵温度＞料水比＞接种量＞发酵时间。

表4 ota脱除率回归模型方差分析table 4 variance analysis of ota removal rate regression model

2.3.3 各因素两两交互作用 黑曲霉发酵麦麸脱除ota的4个影响因素：接种量（a）、发酵温度（b）、发酵时间（c）、料水比（d）两两交互作用对麦麸中ota脱除率影响的响应面图见图5。

图5 各因素交互作用对ota脱除率影响的响应面图fig.5 response surface plots of the interaction of various factors on the removal rate of ota

结合上述结果，交互项bd即发酵温度与料水比的交互作用显著（＜0.05），而交互项 ab、ac、ad、bc、cd的试验结果显著性分析为＞0.05，表明其他交互项之间交互作用不显著。该响应面模型存在最高点，即平面等高线图的圆心，表明在此条件下ota的脱除效果较好。

2.3.4 响应面最优条件的确定 通过上述分析得优化因素为接种量15.05%，发酵温度31.48 °c，发酵时间4.91 d，料水比1:3.27 g/ml。此条件下预测的ota脱除率为58.24%。考虑到实际实验的操作性和可行性，选取接种量15%，发酵温度32 °c，发酵时间5 d，料水比1:3.3 g/ml进行发酵麦麸实验，得到ota脱除率为60.89%±0.93%，与理论值相对误差为2.65%，说明该条件优化参数可行，可用于实际应用中。

对黑曲霉发酵前后麦麸中的挥发性风味物质进行研究。发酵前后总离子流色谱图如图6，黑曲霉发酵处理后的麦麸挥发性物质变化明显。本实验在发酵前后共鉴定出挥发性成分398种，其中酚类24种，醇类84种，醛类42种，酯类116种，杂环类24种，苯环类65种及其他（图7）。

图6 麦麸发酵前后总离子流色谱图fig.6 total ion flow chromatogram of wheat bran before and after fermentation

图7 发酵前后麦麸挥发性风味物质种类与数量fig.7 types and quantities of volatile flavor compounds in wheat bran before and after fermentation

对比发酵前的麦麸，结合t检验得到的值和fc值绘制整体挥发性物质的火山图。如图8 a所示，横坐标为log 2的fc值，纵坐标为-log 10的值，使用log转换缩小差异过大或过小的挥发性物质之间的差异。选取＜0.05，log 2（fc）＞1 或＜-1筛选显著差异物质，蓝色表示显著下调物质，红色表示显著上调物质。发酵后的麦麸挥发性化合物上调了207种，下调了191种8，其中上调最多的壬醇，下调较大的为-萜品烯（图8 b）。壬醇具有玫瑰和橙的香气，是我国gb 2760-86规定为允许使用的食用香料，主要用于本制奶油、桃、橙、柠檬、白柠檬和菠萝等型香精，而-萜品烯则具有柑橘和柠檬似香气，主要用以配制人造柠檬和薄荷精油。所以，黑曲霉发酵后会改变麦麸原有的气味，除此之外，还有许多带有愉快香气的挥发性物质在发酵后产生，如对茴香醛、己酸、-壬内酯、-十一内酯、6-甲-5-庚烯-2-酮等，这些物质可以改善麦麸的风味，以增加动物饲料的适口性。

图8 发酵前后麦麸挥发性风味物质对比分析fig.8 comparative analysis of volatile flavor substances in wheat bran before and after fermentation

发酵后麦麸挥发性物质中占比最大的物质为醇类、酯类与苯环类。表5列举出了一些麦麸发酵前后相对含量变化较大的物质。麦麸发酵前相对含量较多的3-辛酮、3-辛醇和辛烯-3-醇在发酵后含量明显减少。也有许多挥发性物质相对含量升高了。其中香兰素具有香荚兰豆香气及浓郁的奶香，起增香和定香作用，且香气稳定，可为发酵后的麦麸增添独特的香气。

表5 发酵前后麦麸中挥发性物质的相对含量table 5 relative content of volatile substances in wheat bran before and after fermentation

本研究利用黑曲霉fs-uv-21生物发酵麦麸，研究了发酵中的关键因素（接种量、发酵温度、发酵时间、料水比）对麦麸中ota脱除率的影响。并运用响应面法优化上述四个因素，得到最优脱除条件为接种量 15%，发酵温度 32 °c，发酵时间 5 d，料水比1:3.3 g/ml，脱除率为60.89%。并对发酵后的麦麸挥发性风味物质进行研究分析，发现发酵后的麦麸风味物质明显增多，并且不同于传统麦麸风味的挥发性化合物含量增加明显，如壬醇、香兰素等，均可赋予发酵麦麸愉悦的风味。因此，黑曲霉fs-uv-21发酵麦麸不仅能有效降低其中ota的含量，还能提升麦麸的风味，提高麦麸的利用价值。后续还可在此基础上研究黑曲霉发酵的安全性及其降解其他霉菌毒素的可能性，为发酵麦麸将来的绿色健康生产应用提供参考。