刘 欢，吴 薇

(安康学院现代农业与生物科技学院，陕西安康 725000)

魔芋(durieu)属于天南星科魔芋属多年生草本植物，含有多种人体必需的微量元素，广泛应用于食品、药品、农业化工等领域，具有很好的保健功效。陕西是全国四大魔芋主产省份之一，安康魔芋已经被评为中国国家地理标志产品。近年来，随着魔芋种植面积不断扩大，品种逐渐增多，被称为“植物癌症”的各种病毒病逐渐成为制约魔芋产业发展的关键因素。

国内魔芋产区真菌、细菌和病毒病害发生较为普遍，相对于真菌、细菌病害，病毒病害的研究薄弱。由于魔芋以无性繁殖为主，病毒易通过种芋远距离传播，制约魔芋产业持续健康发展。芋花叶病毒(dasheen mosaic virus，dsmv)是天南星科植物最重要的病毒病原之一。dsmv主要在天南星科的大田作物、药用植物以及花卉上侵染为害。其侵染作物后可引起系统症状或隐症现象。据不完全统计，被dsmv侵染的天南星科作物，产量损失能达到60%左右。

dsmv是马铃薯y病毒属()成员，基因组为正义单链rna(+ssrna)，全长约10 kb，仅编码一个大的多聚蛋白，通过自身编码的蛋白酶将多聚蛋白加工成多个具有功能的蛋白，cp蛋白位于多聚蛋白的末端。目前已公布的dsmv基因组信息多来自芋头和马蹄莲，而dsmv魔芋分离物基因组信息却鲜见报道，或者仅有部分基因序列信息。笔者克隆了dsmv安康魔芋分离物完整的基因，并对其进行了分子特性分析，旨在为建立可靠的病毒分子检测方法提供重要信息，并为后续研究其分子致病机制打下基础。

感染dsmv的魔芋叶片采集于安康市农业科学研究院，其叶片症状表现为严重的黄化、畸形和卷叶。取其新鲜叶片保存于安康学院现代农业与生物科技学院分子遗传实验室-80 ℃超低温冰箱备用。

魔芋叶片基因组rna提取与反转录。取0.1 g叶片，加入液氮进行研磨，迅速转入1.5 ml无酶离心管中，按照北京康为世纪的 omni plant rna kit试剂盒提取说明书操作提取rna。以rna为模板，合成cdna，反应总体系为25 μl，包含rna模板3.0 μl，oligo d(18)t(takara，10 μmol/l) 1.0 μl，5×reaction buffer 5.0 μl，dntps(100 mmol/l each)2.0 μl，m-mlv(promega)1.0 μl，ribolock rnase inhibitor 0.5 μl，rna-free water 12.5 μl。

基因扩增与检测。根据 genbank 中登录的 dsmv基因组序列，使用 mega 6.0 进行多重比对，在基因保守区域应用primer premier 5.0 软件设计用于扩增完整的引物cp-f(5′- gcaccatatattgctgaaac -3′)，cp-r(5′-ttttttttttttttttttttttttttttttvn-3′)，引物由西安擎科公司合成。rt-pcr反应体系：cdna模板2 μl，cp-f引物2 μl，cp-r引物2 μl，primestar? max dna polymerase(takara)25 μl，ddho 19 μl。pcr反应程序：98 ℃变性10 s，52 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，进行35个循环。pcr结束后，取5 μl pcr产物进行电泳检测。

pcr产物测序与分析。利用dna回收纯化试剂盒对rt-pcr产物进行回收纯化，将回收产物与pgem-t easy vector进行连接，转入大肠杆菌dh5α，提取质粒送至西安擎科生物公司测序。使用vector nti advance v11.5.2软件中的contigexpress程序，将测序得到的abi文件导入，去除nib和3′-utr基因序列，获得完整的序列。从genbank获得dsmv不同分离物基因序列，使用mega 6.0中的clustalw算法进行多重比对，采用neighbor-joining(nj)法，将bootstrap replications设置为1 000，构建系统发育树。

使用cp-f和cp-r引物，以cdna为模板，pcr扩增得到约1.3 kb的单一条带(图1)，与预期扩增到的基因片段大小吻合。

注：m.ds 2000 dna marker；1.使用cp-f/r扩增健康魔芋叶片样品；2.使用cp-f/r扩增受dsmv侵染的魔芋叶片样品 note：m.ds 2000 dna marker；1.amplify healthy amorphophallus rivieri leaf samples with cp-f/r；2.use cp-f/r to amplify amorphophallus rivieri leaf samples infected with dsmv图1 dsmv cp基因rt-pcr扩增fig.1 rt-pcr amplification of dsmv cp gene

序列经过测序后拼接，使用contigexpress程序去除nib和3′-utr基因序列，最终得到的dsmv魔芋分离物基因全长为903 bp，将完整的dsmv序列上传至genbank 并获得id号(access number：on003977)。

该研究测定了侵染安康魔芋dsmv的cp核苷酸序列，序列比对结果表明，dsmv安康魔芋分离物变异较大，genbank中所有参与比对的序列与该研究获得的dsmv安康魔芋分离物序列的覆盖度仅72%～80%，一致性为80.30%～87.98%(图2)。

图2 比对序列与目标序列的覆盖度fig.2 coverage of the compared sequence and the target sequence

在genbank上获得的dsmv分离物信息见表1，与该研究得到的序列联合分析。系统发育分析表明，dsmv基因可分为3个组(组i、组ii和组iii)(图3)。已公布的dsmv基因多聚集在组i中，这些分离物寄主均是天南星科植物，且分布范围广，从进化树来看，它们并没有寄主特异性，且与寄主地理位置没有明显联系；组ii中仅有来自中国芋头的一个分离物；该研究获得的dsmv 安康魔芋分离物单独归于组iii。

dsmv自然状态下主要侵染天南星科植物，20世纪60年代美国学者在芋头中发现该病毒，之后日本、越南、新西兰等国家相继发现dsmv侵染不同寄主植物。我国学者在20世纪90年代在马蹄莲中通过血清学和电子显微镜检测到dsmv。随后国内学者在芋头、半夏和白附子中相继发现dsmv。由于天南星科植物多数依靠无性繁殖，病毒主要通过种苗传播，亦可通过蚜虫或机械摩擦传播。而我国是天南星科植物种植大国，陕西安康岚皋县魔芋已经被评为中国国家地理标志产品。随着魔芋种植面积增加，加之魔芋常年进行无性繁殖，易导致病毒积累、种性退化，丰产性和品质均难以保证。而目前魔芋病毒病的研究仅仅停留在病原鉴定、田间调查、组织病变和rt-pcr检测层面，魔芋中dsmv发生情况和分子特征却鲜见报道。

表1 从ncbi中获得的dsmv cp序列信息

图3 dsmv cp基因核苷酸序列构建系统发育树fig.3 phylogenetic tree of dsmv cp gene nucleotide sequence construction

该研究克隆了侵染安康魔芋的dsmv基因，并对其进行分子特征分析，表明其为完整的dsmv魔芋分离物基因序列，全长为903 bp，推导编码的外壳蛋白由301个氨基酸组成。从结果看来，前150 bp序列未参与比对，可见其碱基序列差异较大，dsmv魔芋分离物与其他寄主分离物之间存在很大的分子变异。由于genbank中dsmv魔芋分离物序列极少，通过其他寄主分离物联合分析，初步判断dsmv没有明显的寄主专化性和地理位置相关性。

该研究结果为后续dsmv魔芋分离物的分子特征和病害流行学综合研究奠定了基础，同时为魔芋抗病毒育种、建立更可靠的dsmv分子检测技术、全基因组测定和致病机制的研究提供参考。