李建华,杨 雯,屈 玮,吕伯龙,丁 霞,许 晖,何 蕾,姚 丽*

(1.安徽拓维检测服务有限公司，安徽宣城 242000；2.合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽合肥 230601)

肥胖问题逐渐年轻化，小到几岁的儿童，太过肥胖会影响身体健康，导致三高等并发症。越来越多的人开始减肥，但考虑到药物长期累积的不安全性，由纯植物或中药制成的保健品成为越来越多人的选择，因为它们的功效温和、 无副作用产生或副作用小。由于其市场占有率的不断扩大,部分不法商家利用化学药剂成分作用效果显著、快速见效的特点和人们对纯植物、纯中药等健康产品的高度信赖,在这些健康商品中擅自加入说明书中没有标明的化学成分，使通常作用缓慢的现代中成药似乎获得了速效、快捷的好处，夸大产品作用来增加商品销量，谋取不正当利益。西布曲明是一种合成类减肥药物，化学分子式为 chcln,其减肥的作用机制一直被认为是作用于中枢神经系统，通过抑制再摄取去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺，提高去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺在突触间隙的浓度，下丘脑饱食中枢保持兴奋，食欲被抑制，碳水化合物的吸收降低，达到减肥的效果。西布曲明虽有一定减肥功效，但它可能会带来心脑血管还有中枢神经系统不可逆的损伤，严重的心血管风险，心率加快，血压增高，恶心、食欲不振、头晕，还可能导致中风甚至死亡。在我国早已颁布并实施的《食品安全法》第38条明确指出“不得非法向食品中添加任何化学物质”。西布曲明是国家明令禁止添加在保健食品中的一类化学药物，随着人们对食品安全问题的广泛重视，发展快速、经济、灵敏和高选择性的西布曲明检测方法，对于检测保健食品中是否非法添加西布曲明、保障人们食用安全具有重要意义。

对于西布曲明的传统检测方法主要有超高效液相色谱-串联质谱法、表面增强拉曼光谱法、高效液相色谱法、气相色谱-同位素稀释串联质谱法，这些方法虽然灵敏度高、准确性好，但是需要漫长的前处理过程，设备操作烦琐，对操作人员要求高，费时费力，难以满足市场监管时对大规模样品现场筛查的需求。该试验主要利用抗原抗体免疫竞争反应，制备基于胶体金(gold nanoparticles，gnps)标记的侧向层析试纸(lateral flow strips，lfs)，应用于检测非法添加在保健食品中的西布曲明，以期为现场对保健食品中西布曲明的快速筛查提供参考方法。

主要试剂。氯金酸、柠檬酸三钠购于百灵威科技有限公司；蔗糖、碳酸钾、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，bsa)、人血清白蛋白(human serum albumin，hsa)、酪蛋白(casein)、酪蛋白钠(na-casein)购于国药集团化学试剂有限公司；西布曲明标准品购于上海安谱实验科技股份有限公司；西布曲明抗体和包被原购于北京勤邦生物技术有限公司；聚氯乙烯(polyvinyl chloride，pvc)底板、玻璃纤维素膜、吸水垫、硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter，nc膜)和羊抗鼠二抗购于上海捷一生物有限公司。

主要仪器。 高速冷冻离心机，heraeus fresco 17，美国赛默飞世尔公司；电子天平，ja2003，上海力辰科技有限公司；单反相机，a6100l，索尼有限公司；磁力加热搅拌器，jb-3a，上海雷磁有限公司；各量程移液器，芬兰雷勃公司；恒温鼓风干燥箱， 101-1b，鑫熊发仪器有限公司；微型旋涡混合仪，si-0246，美国si科技有限公司；试纸条喷膜仪，xyz-3，美国biodot；试纸条切条机，cm-4000，美国biodot。

胶体金的制备。该研究采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金。将250 ml锥形瓶放在磁力加热搅拌器上煮沸清洗4次，然后向瓶中倒入55 ml双蒸水，在搅拌状态下加入850 μl 5 g/l的氯金酸溶液，加热至微沸后，保持1 500 r/min的搅拌转速不变，迅速向锥形瓶中加入一定体积5 g/l的柠檬酸三钠溶液。观察到瓶中溶液的颜色迅速改变，透明—黑—酒红色，当锥形瓶中液体的颜色不再改变，关闭加热开关，继续搅拌5 min，冷却至室温，4 ℃冰箱保存备用。

胶体金-单克隆抗体耦联复合物的制备。取500 μl胶体金溶液于1.5 ml离心管中，用0.1 mol/l的碳酸钾溶液调节溶液ph为弱碱性，再加入一定体积1 mg/ml的西布曲明单克隆抗体振荡反应1 h后，加入50 μl封闭剂封闭多余的位点，继续振荡反应1 h，8 000 r/min离心10 min，产生红色沉淀；去上清后用重悬液50 μl重悬即可得到西布曲明的金标抗体溶液，制备金标垫。

胶体金试纸条的组装。一个完整的试纸条由支撑底板、样品垫、金标垫、nc膜和吸水垫5部分组成。首先将玻璃纤维素膜切成宽度为17 mm的条状，放置在样品垫处理液中浸泡2 h， 26 ℃烘干备用。然后将西布曲明包被原、羊抗鼠二抗用10 mmol/l磷酸缓冲液(ph=7.4)分别稀释至0.8、1.0 mg/ml，依次吸入喷膜仪后喷至nc膜上，作为检测线和质控线，26 ℃烘2 h至干燥，最后依次将吸水垫、nc膜和样品垫粘贴在底板上，用切条机切割成3 mm宽的条状。

试纸条的检测。在胶体金与抗体耦联过程中，优化抗体添加量、重悬液的种类这2个关键的试验参数，确定最合适的抗体耦联量、重悬条件。

灵敏度检测。将西布曲明标准品溶液用running buffer缓冲液稀释到不同质量浓度，使西布曲明浓度分别为0、5、10、20、30、40、50、100 ng/ml，分别滴加到试纸条上进行测试，反应 10 min后观察试纸条显线结果。

实际样品检测。向某市售减肥类保健食品中添加西布曲明标准品溶液，使样品中西布曲明浓度分别为0、5、10、20、30、40、50、100 ng/ml，分别滴加到试纸条上进行测试，反应10 min后观察试纸条显线结果。

西布曲明是小分子物质，因此基于竞争法检测原理，利用目标物质与包被原对抗体的竞争达到半定量检测的目的，其具体的检测原理如图1所示。样本中的西布曲明标准品和t线上的西布曲明包被原均能与西布曲明抗体特异性结合并且结合的位点相同，即二者互相竞争西布曲明抗体，但西布曲明标准品比包被原的竞争能力更强。当待测样本中不存在西布曲明时，样本流动到金标垫位置时西布曲明抗体与金纳米粒子的耦联复合物未能与西布曲明结合，因此西布曲明抗体表面的识别位点没有被占据，西布曲明抗体与金纳米粒子的耦联复合物到达t线位置时，与西布曲明包被原结合，使t线显现红色，多余未结合的耦联复合物继续流动到达c线位置，羊抗鼠二抗识别西布曲明抗体，二者结合使c线显现红色，最终nc膜上c线和t线位置均显线。当待测样本中存在西布曲明时，样本流动到金标垫位置时西布曲明抗体会与待测样本中的西布曲明特异性结合，西布曲明抗体表面的识别位点被占据，因此西布曲明抗体与金纳米粒子的耦联复合物到达t线位置时，无法与西布曲明包被原结合或减少结合，从而t线颜色削弱或者消失，多余未结合的耦联复合物继续向前流动到达c线位置，羊抗鼠二抗识别西布曲明抗体，二者结合使c线显现红色，最终t线位置颜色较浅或消失，c线正常显现红色。

图1 西布曲明检测原理fig.1 sibutramine detection principle

金纳米粒子与西布曲明抗体耦联复合物对试纸条的灵敏度有极显著的影响，耦联的西布曲明抗体量越大，试纸条灵敏度越低；耦联的西布曲明抗体量较小时，灵敏度提高，但也会影响试纸条c线和t线整体的显线强度。图2是与胶体金耦联的西布曲明抗体量的优化结果，该试验在500 μl体系中分别选择0.5、1.0、1.5、2.0 μl的1 mg/ml西布曲明抗体量进行标记耦联，对制备的4组试纸使用不同浓度的西布曲明进行测试，4组测试所用西布曲明浓度梯度均为0、5、50、100 ng/ml。可见，抗体体积加入的越大，t线显线越强，c线变化不明显，当加入0.5和1.0 μl抗体时，nc膜上t线几乎看不到，c线也较浅，无法很好地辨别阳性和阴性结果；当加入1.5 μl抗体时，灵敏度达到要求，但阴性t线强度仍然较浅；当加入2.0 μl抗体时，阴性t线强度适中，可以很好地区分阴性和阳性。因此最终选择与胶体金耦联的西布曲明抗体量为2.0 μl。

金纳米粒子与西布曲明抗体耦联结束后经过离心去上清，余下的沉淀即二者的耦联复合物，需要重新加入重悬液进行复溶，以保证复溶后耦联复合物的稳定性以及耦联复合物中抗体的活性。因此选择合适的重悬液对试纸条结果的稳定性极其重要。图3是耦联后使用重悬液的优化结果，该试验分别选择50 μl 10% bsa溶液、10% hsa溶液、0.5% casein溶液和0.5% na-casein溶液重悬，对制备的4组试纸使用不同浓度的西布曲明进行测试，4组测试所用西布曲明浓度梯度均为0、5、50、100 ng/ml。可见，10% hsa溶液、0.5% casein溶液和0.5% na-casein作为重悬液时，金标垫释放不完全，导致t线捕获到的胶体金耦联复合物较少，故显线不强；10% bsa溶液作为重悬液时，金标垫释放良好，t线显强线度适中，灵敏度达到要求。因此最终选择10% bsa溶液作为重悬液。

图2 标记抗体量的优化fig.2 optimization of the volumes of the antibody

胶体金试纸条检测西布曲明时，可以通过裸眼观察试纸条的显线情况实现西布曲明的半定量检测。用相机将检测后的试纸条结果拍摄下来，再用软件扫描图片，实现西布曲明的定量检测，结果如图4所示。

图3 重悬液的优化fig.3 optimization of the types of resuspension solution

图4 西布曲明试纸条浓度梯度检测结果(a)和灵敏度检测灰度分析结果(b)以及西布曲明检测标准曲线(c)fig.4 concentration gradient detection results (a),grayscale analysis results of sensitivity detection (b) of sibutramine test strips,and sibutramine detection standard curve (c)

从西布曲明试纸条检测肉眼观察结果(图4a)可以看出,随着西布曲明浓度逐渐增大，试纸条的t线颜色逐渐变弱，西布曲明浓度为50 ng/ml时完全消线。利用image j软件对试纸条测试结果图中c线与t线显色强度的灰度值分析结果(图4b)可以看出c线的峰值稳定，t线的峰值与西布曲明浓度呈反比，随着西布曲明浓度提高而降低，直到50 ng/ml 时完全平缓。从t线灰度峰面积与西布曲明浓度之间的标准曲线(图4c)可以看出,西布曲明浓度在5～50 ng/ml与t线强度之间具有良好的线性关系(=0967 43)。

考虑到实际样品中蛋白、多肽等基质会对试验结果产生影响，先将粉末状样品用甲醇溶解提取，然后离心机6 300 r/min进行7 min离心处理，添加西布曲明标准品使样品中西布曲明浓度分别为0、5、10、20、30、40、50、100 ng/ml，分别滴加到试纸条上进行测试，反应10 min后试纸条显线结果如图5a所示，相应的图像中c、t灰度值分析结果如图5b所示；此外，根据t线强度灰度分析结果与对应西布曲明浓度建立了线性关系，相应关系如图5c所示。

随着西布曲明质量浓度的增大，检测线的显线强度不断减弱，直至50 ng/ml时检测线完全消线(图5a)，质控线显色均匀，与灵敏度检测结果一致。根据显色结果作出灰度扫描图，可以看出t线信号强度峰值随着西布曲明浓度的增加而不断降低，直至平缓(图5b)，根据t线灰度值与实际样本中西布曲明浓度之间建立线性关系(图5c)可以看出，西布曲明浓度在5～50 ng/ml具有良好的线性关系(=0.973 84)，表明该试纸条可应用于实际样品的检测。

胶体金免疫侧向层析法是一种以胶体金作为示踪标记物，以抗原抗体特异性反应为基础，是现场筛查的有力工具，因其简单、便携、长期稳定性和成本低而在实际应用中越来越受到关注。该试验构建了国产蛋白标记的试纸条快速检测减肥类保健食品中违禁添加的西布曲明，样品无需任何复杂的前处理，10 min内即可获得检测结果。与已报道的代表

图5 西布曲明实际样本试纸条检测结果(a)和试纸条灰度分析结果(b)以及西布曲明实际样品检测线性关系(c)fig.5 test results of test strips (a) and grayscale analysis results of test strips (b) of sibutramine actual samples,and the sibutramine actual sample detection linear relationship (c)

性方法相比，lfs法操作简单、易于制备，通过直观观察，实现了低至50 ng/ml的可视化检测限，制备的试纸条特异性良好、灵敏性高，可用于实际样品的现场快速检测，为市场监管过程中大批量样本检测需求提供便利。