朱秋燕 曾鑫冰 杨筱倩 谢若曦 李笑 黄小平 邓常清

〔摘要〕 目的 采用網络药理学方法，以髓鞘再生的主要功能细胞少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor cells， opcs）为靶点，预测益气活血开窍组分中药有效成分对脑缺血后白质损伤的促修复作用。方法 从tcmsp、pubchem、swisstargetprediction数据库中预测组分中药主要有效成分促进脑卒中后opcs修复脑白质的作用靶点;整合geo、genecards和ctd数据库中获得的脑卒中疾病靶基因，通过string绘制“中药组分-疾病”靶点ppi网络图;并进行go及kegg富集分析。同时，采用大鼠脑缺血再灌注模型，从神经功能和形态学评价益气活血开窍组分中药对脑缺血再灌注后脑白质损伤的促修复作用。结果 网络药理学共获取33个疾病-药物共同潜在靶点。ppi网络及拓扑分析结果显示vegfa、ptgs2、ntrk1、esr2和met等可能为核心作用靶点，富集分析主要涉及钙离子、pi3k-akt、vegf、rap1、ras、egfr酪氨酸激酶抑制剂抗性和mapk信号通路，kegg富集分析geo数据集差异基因结果显示，卒中5 d和15 d均涉及pi3k-akt信号通路。药理学实验结果显示，益气活血开窍组分中药可改善脑缺血再灌注后大鼠神经功能障碍，减轻脑白质损伤和大鼠胼胝体、纹状体髓鞘脱失。结论 益气活血开窍组分中药可改善脑缺血再灌注后白质损伤，机制可能与各有效成分通过多靶点、多途径促进髓鞘再生和白质修复有关。

〔关键词〕 网络药理学;益气活血开窍组分中药;脑缺血再灌注;髓鞘再生

〔中图分类号〕r285.5 ? ? ? 〔文献标志码〕a ? ? ? ? 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070x.2022.06.012

network pharmacology reseach and pharmacodynamic validation of the ingredient chinese

medicine with qi-benefiting， blood-activating and resuscitation on white matter

protection after cerebral ischemia

zhu qiuyan1，2， zeng xinbing1，2， yang xiaoqian1， xie ruoxi1，2， li xiao3， huang xiaoping2*， deng changqing2*

（1. laboratory of vascular biology， hunan university of chinese medicine， changsha， hunan 410208， china; 2. hunan key laboratory of cerebrovascular disease prevention and treatment of integrated traditional chinese and western medicine， hunan university of chinese medicine， changsha， hunan 410208， china; 3. medical college of hunan university of chinese medicine， changsha， hunan 410208， china）

〔abstract〕 ive through network pharmacology， to predict the promoting and repairing effect of effective components of the ingredient chinese medicine with qi-benefiting， blood-activating and resuscitation on white matter injury after cerebral ischemia with oligodendrocyte precursor cells （opcs）， the main functional cells of myelin regeneration. methods tcmsp， pubchem and swisstargetprediction data s were used to predict the targets of the effective components of ingredient chinese medicine in promoting white matter repair of opcs after stroke; geo， genecards and ctd data s were used to search the stroke targets; ppi network diagram of "ingredient chinese medicine-disease" targets was drew through string， and preformed for go and kegg enrichment analysis. meanwhile， using the rat cerebral ischemia-reperfusion model， the promoting and repairing effect of effective components of the ingredient chinese medicine with qi-benefiting， blood-activating and resuscitation on white matter injury after cerebral ischemia was evaluated from neurological function and morphology. results a total of 33 drug-disease common potential targets were identified in network pharmacology. ppi network and topology analysis revealed that vegfa， ptgs2， ntrk， esr2 and met， etc. may be important targets， enrichment analysis mainly involved calcium， pi3k-akt， vegf， rap1， ras， egfr tyrosine kinase inhibitor resistance and mapk signaling pathways. kegg enrichment analysis of differential genes in geo data sets showed， pi3k-akt signialing pathway was involved in both 5 and 15 days of stroke. pharmacological experiments showed that the ingredient chinese medicine with qi-benefiting， blood-activating and resuscitation can improve neurological function and mitigate white matter injury after cerebral ischemia-reperfusion， reduce white matter injury and demyelination of corpus callosum and striatum in rats. conclusion the ingredient chinese medicine with qi-benefiting， blood-activating and resuscitation can effectively improve white matter injury after cerebral ischemia-reperfusion and the effect may be closely related to the multi-target and multi-pathway promotion of myelin regeneration and white matter repair by each active ingredient.7e3093fa-79f3-495c-8636-0d4d21cc5d88

〔keywords〕 network pharmacology; ingredient chinese medicine with qi-benefiting， blood-activating and resuscitation; cerebral ischemia-reperfusion; remyelination

脑梗死是严重危害人类健康的疾病，具有高致死率和致残率的特点[1-3]。脑缺血可导致严重脑损伤、神经细胞迅速损伤和死亡[4]。长期以来，脑缺血后的神经修复研究侧重对神经元或灰质损伤的保护，而近年来，研究证明脑白质完整性对于脑卒中后长时程神经修复具有重要意义[5-6]。脑白质是大脑内神经纤维聚集区域，约占人脑体积50%，也是关键损伤部位，它可破坏神经元之间、皮质和皮质下中枢之间的信号传递，也可造成神经纤维投射区的灰质损伤，对神经元造成二次伤害，是脑缺血后神经功能难以恢复的重要原因[7-9]。

脑白质主要位于脑胼胝体、纹状体等区域，由少突胶质细胞（oligodendrocytes， ols），ols突起形成的髓鞘及髓鞘包裹的神经元轴突三部分组成。脑白质的主体是ols，ols来源于脑白质原位的少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor cells， opcs）以及室管膜下区（subventricular zone， svz）的多潜能神经干细胞[10]。脑缺血后，白质中的ols损伤导致神经轴突髓鞘脱失，而成熟的ols缺乏增殖能力，必须依赖新生成的opcs增殖分化为成熟ols，形成新的髓鞘，此即“髓鞘再生”[11-12]。opcs是白质修复的关键细胞，因缺血等因素诱导的脑内源性白质修复作用十分有限，局部炎症、氧化应激、兴奋毒性等因素导致脑内环境的改变也不利于opcs的存活和修复[13]。由于白质修复涉及opcs增殖、分化与成熟等复杂过程，因此，单一措施的促白质修复作用往往有限，应该从多环节、多途径寻找促进其修复的措施。

中医药研究表明，脑梗死的基本病机是气虚血瘀，治疗应益气活血。黄芪和三七是治疗心脑血管疾病的常用中药，可有效减轻脑损害，改善脑梗死患者神经功能缺损症状。黄芪甲苷（astragaloside Ⅳ， astⅣ）是黄芪抗缺血性脑卒中的主要活性成分[14]，三七总皂苷（panax notoginseng saponins， pns）是三七的主要药效组分，主要含人参皂苷rg1、人参皂苷rb1、人参皂苷re、人参皂苷rd、三七皂苷r1[15]。冰片有开窍醒神之功，多用于中风、痰热、神昏窍闭等证，其主要有效成分为左旋龙脑[16]。前期研究发现，以冰片配伍ast Ⅳ与pns的益气活血开窍组分中药可促进脑缺血再灌注后药物成分入脑，且可促进脑缺血后神经元增殖和内源性神经发生，减轻脑微血管损伤，具有促神经修复的作用[17-18]。由于脑缺血后的炎症反应、氧化应激、能量代谢与细胞凋亡等同样可影响opcs的增殖、分化，从而影响脑白质修复。因此，推测该组分中药也可能具有通过促进髓鞘再生发挥对脑缺血后白质损伤的修复作用。为了验证这一推测，本研究首先用网络药理学方法预测了该组分中药中的主要有效成分对脑缺血后opcs髓鞘再生的作用及可能的靶点，然后采用体内实验初步探讨了其促进脑缺血再灌注后白质损伤的修复作用，以期为后继研究奠定基础。

1 方法

1.1 ?益气活血开窍组分中药作用脑卒中后opcs髓鞘再生的潜在靶点预测

1.1.1 ?ast Ⅳ、冰片和pns主要有效成分潜在靶点的预测 ?在中医药数据库与分析平台（tcmsp）[19]及pubchem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中获得ast Ⅳ、冰片主要活性成分（左旋龙脑）、pns 5个主要活性成分（人参皂苷re、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1和人参皂苷rd）的cas号，输入pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中获取smiles号，将ast Ⅳ、冰片主要成分、pns中5个主要活性成分（人参皂苷re、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1和人参皂苷rd）的smile号输入swisstargetprediction数据库（http：//swisstargetprediction.ch/）中，获得ast Ⅳ、冰片和pns中活性成分的作用靶点。

1.1.2 ?脑卒中后opcs髓鞘再生靶标基因获取 ?在gene omnibus （geo）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库中，以“white matter”and“stroke”and“oligodendrocyte precursor cells”为检索式，获取芯片编号为gse53737的高通量测序数据集。该数据集由25个样本的基因表达数据组成，包括10个对照样本（非卒中）、8个卒中5 d样本和7个卒中15 d样本。本研究比较了卒中5 d与卒中15 d的差异表达基因（differentially genes， degs），以p