(北京师范大学生命科学学院，北京 100875)
摘 要：在农林牧业生产中，植物转基因沉默是造成转基因植物非孟德尔遗传的主要原因，对于转基因作物的利用产生了非常不利的影响，已成为影响转基因技术推广应用的主要问题之一，本文通过从外源基因转化前的防止及转化后的抑制两方面就目前常用的策略做一总结。
关键词：转基因沉默；植物；遗传
中图分类号：q943.2  文献标识码：a  文章编号：1007—6921(2007)08—0077—04
      自1983 年世界第一株转基因烟草诞生至今，外源基因可以通过不同的转化方法进入植物基因组整合并且表达，目前已有种。可以说，目前基因的转化方法已不再是转基因的吸纳之因素，然而由于外源基因在植物体内的地遗传性为非常复杂，因此转基因能否在植物体内稳定的整合、遗传和表达就决定了转基因植物的使用价值。转基因植物的外源基因的遗传行为与经典遗传规律差异很大，基因的分离表现为非孟德尔遗传，而当以转基因的表型分离比确定转基因的遗传类型时，转基因沉默是造成非孟德尔遗传的首要原因。转基因诱导的基因沉默是植物遗传转化过程中的普遍发生，在谷类中，有超过50%的转基因在世代传递过程中发生基因沉默。可见，转基因沉默已经成为阻碍转基因技术推广应用的主要问题之一。
      人们对植物转基因沉默的机制已有一些了解，但总的来说还比较零散，尚不成系统，仍有许多问题需要解决。目前，植物转基因沉默的分类主要有两种分类方法：一类是将其分为位置依赖性沉默(sds)和同源依赖性沉默（hdgs）；另一类是分为转录水平沉默(tgs)和转录后水平沉默(ptgs)。可这两类分类系统相互包含，并不是很好的分类方法。这种混乱的情况可能也说明植物转基因沉默机制的复杂性尚未被人类揭晓。但是，人们并不能因此停止对转基因植物的研究，因此如何利用现在已经掌握的一些关于转基因沉默的机制从而抑制转基因植物发生基因沉默对于人类能否更好的使用转基因植物具有重要意义。关于植物转基因沉默的优秀综述非常多，因此本文主要以转基因沉默抑制策略出发，在详述抑制策略的过程中穿插一些关于植物转基因沉默的机制研究现状。根据转基因沉默抑制策略的时间先后，可以将抑制策略大致分为转化前防止与转化后抑制。
1 外源基因转化前防止策略
      转化前抑制是指在将外源基因转入植物之前，修饰外源基因，选择适当的转导方法，以达到优化外源基因密码子、避免同源序列等目的，从而避免植物自身发生转基因沉默或者降低其发生转基因沉默的概率。
1.1 避免使用同源序列
      同源序列是公认的产生转基因沉默的主要诱因，其转录可能会造成某种内源mrna的过表达，从而导致rdrp被激活，由于rdrp能够指导不依赖引物的rna互补链的合成，从而产生dsrna，进而发生rna沉默。如1990年，jorgenson等人试图将查耳酮合成酶基因转入紫花矮牵牛中以加深其颜色，但结果却显示一些花色不但没有加深，反而表现为杂色，甚至纯白色。这可能就是由于同源序列使得内源基因和外源基因被同时沉默的共抑制现象。因此，在构建表达载体时，应尽量降低所设计序列与宿主植物内源基因的同源性，从而避免共抑制现象的发生。
1.2 修饰外源基因
      由于对于某种植物，其基因组中所含有的碱基组成比较固定，或者富含gc，或者富含at。而gc或at的含量在不同种间又具有差异，称为gc等容线（isochore），因此，如果外源基因整合到植物dna上后，会受到两侧dna序列的影响。如果外源基因的gc含量与整合位点差异较大，就会因此而被识别，造成外源基因dna的甲基化，从而关闭基因的，发生转基因沉默。如玉米中al基因的gc含量为52.5%，而在转al基因沉默的矮牵牛中，al基因两侧dna序列的gc含量分别为26%和23%，明显低于52.5%，检测到al基因超甲基化，然而其两侧dna的甲基化程度则不高。这说明，植物体内有一套识别系统能够通过比较外源基因与两侧dna的gc含量来识别外源基因，进而激活甲基化酶，使外源基因甲基化。perlak f.j.在培育抗虫棉bt时，通过改变其hd-1和hd-73内毒素基因的密码使用，使gc含量提高，并去除一些at序列，从而得到了无转基因沉默的抗鳞翅目一些昆虫的抗虫棉，这种抗虫棉已于1996年大规模种植。
1.3 选择偏爱密码子
      基因的高效表达除了还与载体生物使用的密码子及trna的数量匹配关系有关。这主要有以下三个原因。第一，虽然对于所有生物来说其密码子基本相同，但是对于不同种属的生物，还是存在偏爱的密码子，而且其偏爱的程度各不相同。例如：e.coli中很少使用agg、cga和cgg。在编码arg时，由于e. coli中与agg相应的trna数量很少而造成含agg密码子的外源基因低效表达。第二，基因碱基的配对是可以移动的，不过这种移动是有一定规则的，而且不同的生物遵循规则并不完全一致。第三，不同种类的生物含有不同种类的trna，不同trna解读密码子的能力并不相同。因此外源基因进入宿主基因组后，被正确解读的几率发生差别，也有可能导致基因沉默。例如：在拟南芥有6个主要的谷氨酰胺酶(gln)基因：gln1-5基因产生的是谷氨酰胺酶(gs-1)与gln-6产生的谷氨酰胺酶(gln-2)是二个同工酶，这几个基因的密码不一样。因此，优化密码子，使用宿主植物偏爱的密码子，使转入的外源基因的密码子能够适应宿主植物的trna，也是避免基因沉默的一个策略。
1.4 使用核基质结合序列
      核基质结合序列mar(matrix attachment region)，又称核骨架结合区sar(scaffordattachment region)，是染色质上的一段序列，长度一般为300～1 000bp，通常富含at，它可以与核骨架相结合。两个mar之间的染色质区域可形成大小为5～200kb的dna环，构成一个独立的表达结构。利用mar的这个特点，在转基因的两侧翼接上mar序列，mar通过对染色质结构的直接限制，使转基因不能形成稳定的凝聚染色质结构，从而保证了转录的正常进行，并使染色质处于开放模式——使rna聚合酶容易接近这种结构——从而提高了转基因的表达效率。另外，由于mar能使转基因形成一个独立区域，不受周围染色质顺式调控元件的影响，使相
邻的转录单元保持相对的独立性，从而使转基因稳定表达，消除外源基因由于位置效应而被沉默。
      近来多项研究表明：利用mar与转基因构件转化载体协同转化植物后，转基因植物中转基因的表达量大幅度提高，同时避免了转基因的位置效应和转基因的沉默。如mar序列的存在可以有效地缩小β-葡糖苷酸酶（β-glucuronidase，gus）基因在转基因植物当代和子代表达的变化程度。在外源基因不超过40个拷贝数的情况下，mar的存在可以显著降低共抑制效应。在转基因杨树中，烟草mar序列的存在可以使gus表达量平均提高10倍，并且可提高抗性芽产生的频率。
1.5 利用优良的转化和重组系统
      例如：基于ac/ds转座系统建立的转化载体，lebel等人借助于该系统，通过基因直接转化法，把10kb的大片段以完整单拷贝的方式整合进受体细胞基因组；利用酵母线粒体Ⅰ-sceⅠ核酸内切酶，特异性断裂植物dna双链的同源重组系统，将外源dna整合到染色体的特定位点上：puchta等利用该系统发现，通过利用该系统能使在特定位点的同源重组频率增加2个级别，因此我们可以利用这种系统，利用转基因与内源基因间的同源性，在特定位点用转基因来置换内源基因，从而来避免共抑制现象的发生；利用双元细菌人工染色载体系统(binary bacterial artificial chromosome，bibac)稳定整合大片段外源dna到宿主基因组中：hamilton等报道，利用bibac载体把150kb的外源dna整合到烟草中，并且整合的完整外源dna能在后代中稳定遗传；利用细菌噬菌体p1cre-lox，酿酒酵母flpfrt和结合酵母rrs位点特异性重组系统，这类系统可将外源基因以单拷贝，位点特异的方式整合到事先整合有lox，frt，rs位点的植物上：albert，vergunst等两个研究小组先后成功地利用细菌噬菌体p1cre-lox系统将t-dna以单拷贝、位点特异的方式整合到烟草和拟南介中，实现了转基因的稳定表达利用具有新型筛选标记基因的转化载体，如磷酸甘露糖异构酶。这类载体转化效率高，对细胞生长具无害性，有利于转基因植株的高效表达。
1.6 选择合适的转化方法
      目前，植物基因工程种外源基因的转化方法非常多，常用的有农杆菌介导法和基因枪法。在真核生物的染色体中，染色体的末端富含常染色质，属于基因富含区；近着丝粒区则相反，富含异染色质，活性基因稀少，这种染色体水平上的修饰产生后成状态，并不必需要甲基化。例如，在酵母和果蝇中，转基因沉默往往起因于异染色质化，而大多数高等植物基因组中除着丝粒和端粒外，中间区也含有大量的异染色质和重复dna。
      由于基因枪法所转入的外源基因容易落于异染色质区域，而农杆菌介导法导入的基因多进入染色体的末端，所以为了能够使得外源基因正常表达，农杆菌介导法明显优于基因枪法。另外，基因枪法导入的外源基因为多拷贝，而农杆菌介导法能够减少导入外源基因的拷贝数，减少多拷贝植株的数量，并且已经可以实现外源基因的单拷贝，从而避免重复序列产生的基因沉默现象。由于多拷贝的外源基因以正向或者反向串连的形式整合在植物基因组上而导致的外源基因不同程度的失活，叫做重复诱导的基因沉默（rigs）。
      高等生物基因组含有大量重复序列及多拷贝基因，但这些重复序列并未发生失活现象，可见其自身的重复序列并无影响。然而外源基因拷贝数的多少能在不同程度上造成转基因失活。如果重复序列串联或者紧密连锁在在一起就形成顺式失活(cis-inactivation)；由于重复序列位于染色体的不同位置所会造成反式失活(trans-inactivation)。其中反式失活是指某一基因的失活状态引起同源的等位基因或非等位基因的失活。启动子区域只要有90bp的同源性就可以引起基