项目名称：同时检测torch-igm抗体免疫层析试纸条的研制
及产业化研究
领    域：生物技术
起止时间：2007、01 — 2009、12
**区科学技术局
二oo七年三月 

一、立项的背景和意义
torch是指可导致先天性宫内感染及围产期感染而引起围产儿畸形的病原体。首先由nahmias于1971年采用一组病原微生物的英文名称首字母缩写而成，其中t（toxoplasma gondii,tox）是弓形体、r(rubella virus,rv)是风疹病毒、c(cytomegalovirus,cmv)是巨细胞病毒、h(herpes simplex virus,hsv)是单纯疱疹病毒，o（others）是eb病毒，hiv病毒和人细小病毒b19等。这些病原体均可引起胎儿的早产、流产、宫内发育迟滞、畸形、死胎和新生儿死亡等。
胎儿torch的感染致畸与母体的感染有密切关系[1-5]。弓形体病为人畜共患寄生虫病，孕妇急性感染，约30～40%可传给胎儿造成各类先天畸形；妊娠第一个月时风疹感染致胎儿先天畸形的发病率达50%，第二个月为30%、第三个月为20%、第四个月5%，风疹是引起婴儿畸形的主要原因；据报道，日本每年可出生先天性cmv感染小儿5000例，其中有症状者达400～500例，因而把预防母体cmv初感染作为侧重点，对不具有cmv特异抗体的育龄妇女进行医学干预；hsv分Ⅰ、Ⅱ两个血清型，胎儿及新生儿的感染多是经胎盘和产道垂直传播所致,新生儿hsv感染的发病率约1/3500～1/5000活产儿，多数由Ⅱ型引起。
以上说明孕妇torch感染是不良妊娠结局的重要原因，对优生优育与人口素质构成很大的威胁，因此对孕期进行torch筛查是十分必要的。经过大量的研究，人们发现孕期torch感染相当普遍（约90%），但只有近期或活动性感染才会危及胎儿，引起胎儿畸形等不良后果。torch特异性igm是近期和活动性感染指标。
目前临床上检测torch-igm抗体常用的是elisa法，其操作程序比较复杂，检测时间较长，不适应孕妇感染的快速诊断和怀孕人群的筛查。而我们拟研制的“同时检测torch-igm抗体的胶体金快速检测免疫层析试纸条”，只需一次加样（加血清标本）操作就可鉴定出是torch中何种病原体近期感染，检测方法快捷、不需要特殊仪器，大大方便了临床检测和筛查工作，尤其适合于基层计划生育服务站和妇保院检测使用。
本项目组从2006年已开始进行“同时检测torch-igm抗体免疫层析试纸条”的前期研究工作，经过一年的试验摸索，取得了阶段性的成果，积累了一定的工作经验，对拟要开展的“同时检测torch-igm抗体免疫层析试纸条的研制和产业化研究”项目成功打下了坚实的基础。
“同时检测torch-igm免疫层析试纸条”研制技术来源是引进消化吸收再创新的自有技术，是独立研制、并使之能产业化的项目。
本项目是利用本公司有较强推广和销售优势和本地区科研单位仪器设备先进、科研技术力量雄厚优势相联合，实现研、产、销一体化。
我国每年大约有1700万人口出生，政府和家庭对优生优育都非常重视，本项目产品，有着巨大市场前景，预期将产生良好的社会经济效益，对提高出生人口素质、减少出生缺陷和残疾有重要的意义。
参考文献
[1] 宋志琴,吕滨江,张爱玲. 孕妇torch感染对胎儿的影响[j].中国优生与遗传杂志2002,10(3):72-73.
[2] 何友雄，吕元聪. torch母婴传播的研究进展[j].预防医学情报杂志,1998,14(1)27-30.
[3] 周吉海，谭季春. 日本torch感染研究近况[j].日本医学介绍2002，23(8)：377 - 379.
[4] cullen a, brown s,cafferkey m,et al.current use of the torch screen in the diagnosis of congenital infection[j].j infect, 1998,36(2):185-188
[5] newton er. diagnosis of perinatal torch infections[j]. clin obstet gynecol.1999，42（1）：59-70
二、国内外现状和发展趋势
目前诊断torch感染的方法主要有下列三种：1、病原体的培养分离，该方法准确性高，但由于操作复杂、费时较长，即使改良的方法也需要16-24小时检测时间，现在很少在临床诊断中应用。2、聚合酶链式反应（pcr），该方法灵敏度高、快速，可直接检测病原体，但对实验室和试剂的要求比较高，否则结果十分不可靠。3、酶联免疫法（elisa）测定血清抗体。这是目前医院和计划生育部门普遍开展的检测torch感染的方法，其主要测定血清中抗torch病原体的特异性抗体igg和igm，如果igm阳性，表示孕妇近期有torch感染（或称原发性感染），有引起胎儿畸形的可能，如果igg阳性，表示过去有过torch感染，对胎儿的影响不大。elisa法试验操作除了需要把结合标记物与自由标记物分离而进行两次十遍洗涤步骤外，还需要三步加样（一步加血清标本和两步加诊断试剂），两步温育操作，检测比较繁琐，检测时间比较长，不能满足临床快速检测的需求，也不适应对人群的筛查。
免疫层析技术是在elisa技术的基础上发展起来的一种快速免疫分析技术，它省去了繁琐的加样、操作简单、快速。其原理是借助毛细管作用，样品在条状纤维制成的膜上游动，其中的待测物与膜上一定区域的配体结合，通过着色标记物，短时间内便可得到直观的结果。
1990年beggs等[6]应用胶体金为标记物建立了免疫层析试验，检测人尿和血清中绒毛膜促性腺激素（hcg）。它是将含有胶体金-抗α-hcg单抗络合物的玻璃纤维垫贴于硝酸膜的一端，中间是用抗体包被成“+”字型的检测区，其竖线包被的是抗-β-hcg多抗的f(ab)2片段，横线是抗鼠igg多抗。另一端是含ph指示剂的终点指示区。加样后，玻璃纤维垫上的络合物与样品中的hcg结合，复合物在毛细管作用下向上游动，在检测区与抗体结合形成“+”号，如无hcg，络合物只与横线上的多抗结合成“-”号。当溶液游动到另一端时，指示剂变色，表示试验结束，可以读取结果。1991年horton等[7]将金标免疫层析试验进行技术改进检测鼠igg，将固定有羊抗鼠igg的膜进行封闭并把胶体金标记的羊抗鼠igg加于保护剂处理过的一端，在该端加样品进行层析。1999年arao等[8]用三种材料来制作层析试纸条检测尿中乳铁蛋白，它是先将抗乳铁蛋白抗体和兔抗鼠igg（对照线）固定在apc膜上，干燥后用蛋白封闭，胶体金标记的另一鼠抗乳铁蛋白抗体点在玻璃纤维膜的一端，用醋酸膜作吸水纸，各膜依一定顺序贴于聚苯乙烯上，检测时将样本加在玻璃纤维膜金标抗体的上游。10min后即可观察结果。2000年侯惠仁等[9] 以复合型层析材料为固相，用胶体金标记afp mcab a14c11，固相包被afp mcab a4a14，采用双抗体夹心免疫层析技术，研制出afp免疫层析测试条,敏感度为10 ng/ml。2004年江静等[10] 研制出的免疫层析测试条，检测尿液中的甲基苯丙胺，敏感度可达1ng/ml。
近年来胶体金免疫层析技术作为一种免疫类新技术，发展十分迅速，在生物医学各研究领域特别是在医学检验中得到了日益广泛的应用，现在，国内外销售的金标免疫层析试验的成品多达几十种，如检测感染性疾病抗原（hbsag、hbeag、疟原虫抗原、大肠埃希菌抗原等），检测抗体（tb-ab、hp-ab、hbsab、hiv-ab、抗登革热抗体等），检测蛋白质（afp、癌胚抗原、肌红蛋白、肌钙蛋白、尿微量白蛋白、粪便血红蛋白等），检测激素（hcg，lh 、促卵泡生成素、促甲状腺激素），检测药物（毒品类，如吗啡、可卡因、鸦片、大麻、安非他命及摇头丸等）。随着免疫分析固相技术的发展和生化试剂制备技术的进步，免疫层析法将是诊断试剂的发展方向之一。
实现检测多元化是免疫层析试验的一个重要发展方向，一次检测可同时得到一组结果，这对于检测某些具有联检意义的物质具有很大的应用价值，如hbsag、抗hiv抗体以及抗hcv抗体的检测组合对献血员检查更为方便。buechler等[11]采用一膜包被多条抗体带（包括阳性对照和阴性对照）的方法，同时检测尿中的七种危禁药物。
医院，尤其是计划生育服务部门筛查孕早期或孕前妇女是否有torch急性感染，往往一份血清标本需要同时检测抗弓形体、抗巨细胞病毒、抗风疹病毒和抗单纯疱疹病毒ii 型igm抗体四项指标。我们拟研制的试纸条就是为此需求而设计的，我们先把强抗原性的tox、rv、cmv、hsv-ii型四种抗原同时包被在硝酸纤维膜上，然后再把已处理好的四种材料（样品垫、着金结合垫、固化的硝纤膜、吸收垫）按一定顺序贴于聚苯乙烯上，组装成试纸条，检测时把人血清加在加样区（样品垫）后，放置一段时间，用肉眼观察就可以鉴定出是否有或是哪种torch病原体急性感染。操作非常简便，无需多次加样和用多个试剂盒检测，在围产期检查中具有很大的应用价值。
本项目组对“同时检测torch-igm抗体免疫层析试纸条”已进行了为期一年的试验摸索，已在胶体金的制备、胶体金标记抗体的制备、试纸条的装配和检测等方面做了大量的基础性工作，取得了阶段性成果。
参考文献
[6] beggs m,novotny m,sampedro s,et al. a self-performing chromatography immunoassay for the quanlitative determination of hcg in urine and serum [j]. clin chem,1990,36(6):1084-1085
[7] horton j, swinbume s,sullivan m. a novel,rapid,single-step immunochromatographic procedure for the detection of mouse immunoglobulin[j]. j immunol method,1991,140:131-134.
[8] arao s, matsuura s,nonomura m,et al.measurement of urinary lactoferrin as a marker of urinary tract infection[j].biotech bioengin,1999,62(2):145-154.
[9] 侯惠仁，吴冯波，陈